1测序技术及应用.docVIP

第二代测序（Next Generation Sequencing）概念：二代测序技术（next-generation sequencing）是对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 基本原理：边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上通过技术创新用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。 特点：速度快，准确度高，成本低，覆盖度深，产出巨大 应用：定性方面的研究，基因组学的从头测序和重测序、小RNA的研究、转录图谱的分析以及染色体结构表观遗传学。定量方面，DNA的拷贝数，基因的表达量。两种技术454测序仪 读长：400bp 通量：500Mbp，测序技术：Polony（2005年哈佛George Church实验室发展起来的，基于乳化PCR(emulsion PCR)和自动显微镜等技术的测序方法。） 实验过程： 1）样品输入并片段化 GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。短的PCR产物则可以直接跳到步骤3)。 2）文库制备 借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。 3）一个DNA片段＝一个磁珠 单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 4）乳液PCR扩增 每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。 5）一个磁珠＝一条读长 携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。 6）数据分析 GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序 HiSeq (Illumina)测序仪 读长：40-150bp 通量：200Gb 测序技术：polony（Solexa公司开发了一种可反转的染料终止法。DNA模板首先连接到与固体介质（如玻璃板）交联的引物上，并扩增形成本地微克隆。四种ddNTPs依次添加到体系中，未结合的ddNTPs在添加下一种核苷酸前被冲洗走。与454的焦磷酸测序不同，这种方法一次只延伸一个碱基。） 实验过程： 1）添加接头 利用物理方法将待测样品利用物理方法将待测样品利用物理方法将待测样品利用物理方法将待测样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端加上接头碎片两端加上接头碎片两端加上接头碎片两端加上接头(1)。 2）表面结合 Solexa的测序时利用微注射系统将已经加过接头和待测片断随机添加到璃璃Flow Cell，每个Flow Cell又补分成8条lane，每条lane的内表面上能与共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的代测序列DNA片段。 3）桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA片断 在Flow cell内加入未被标记的dNTP和酶起始固相桥型扩增(3)所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环将会在Flow cell的固相表面