hBSP稳定转染乳腺癌细胞的筛选和鉴定.pdfVIP

·874· hBSP稳定转染乳腺癌细胞的筛选和鉴定木 杜红延▲王捷△ 郑霖杨静刘大志 广州军区广州总医院医学实验中心(广州510010) 【摘要】 目的筛选和鉴定人骨唾液蛋白(BSP)的荧光蛋白非融合表达载体和膜靶向表达载体稳定转染的 G418的 乳腺癌细胞，为BSP在乳腺癌骨转移中作用的进一步体内、外研究奠定基础。方法经过4周400熠／ml 等方法检测和鉴定BSP在乳腺癌细胞中基因水平和蛋白水平的表达情况。结果筛选获得的乳腺癌细胞中BSP 得到稳定表达，以B一肌动蛋白为内参，与空白对照相比BSP蛋白在基因水平上灰度比值从0．446分别增加为 结论稳定高表达BSP的乳腺癌细胞的获得为进一步BSP在乳腺癌骨转移中的作用的体内外试验研究奠定基础。 【关键词】 骨唾液蛋白稳定转染乳腺癌细胞筛选鉴定 近年来许多研究结果显示BSP与乳腺癌骨转移有 于24孔细胞培养板进行G418粗筛，使终浓度达到 400 着密切的关系nq】，为了进一步研究BSP在乳腺癌骨 tLg／ml，培养4周，利用流式细胞仪的荧光分选系 转移过程中的作用，首先要获得BSP稳定转染的乳腺 统分选带有荧光的细胞，荧光激发光波长为488nnl。 癌细胞。经过BSP真核表达载体的构建和转染，筛选 和鉴定就成为获得稳定高表达BSP乳腺癌细胞的保 —PCR扩增6sp片段，以B一肌动蛋白为内参进行半定 证。由于各真核细胞系对G418敏感度不同，经过优化 量。BSP蛋白扩增400 bp的片段引物序列如下：上游 确定稳定转染乳腺癌细胞筛选所需的G418浓度为 400 0e／m1【4J。本研究旨在对BSP稳定转染乳腺癌细 胞的筛选和鉴定，为进～步对BSP在乳腺癌骨转移中 反应体系50止，94℃处理2．5min，加入Taq酶，进人 的作用的体内外试验研究奠定基础。 循环，94℃变性1rain，62℃退火1rain，72℃延伸45S， 1材料与方法 30个循环后于72℃延伸7min，冷至4。C。内参B一肌 动蛋白扩增202 1．1材料 bp的片段引物序列如下：上游引物5’ 1．1．1细胞特异性骨转移人乳腺癌细胞株MDA— MB一231BO，广州军区广州总医院医学实验科保存。 94℃处理2．5 经重组表达质粒pIRES2一hBSP—EGFP和plD—hBSP 1 min，55℃退火1rain，72℃延伸30s，30个循环后于 —EGFP转染的乳腺癌细胞MDA—MB一231BO，自行 72℃延伸7min，冷至4℃。 建立‘4一引。 1．1．2试剂RT—PCR试剂盒、D12000DNAMarker、 o×174一HaeⅢDNA 定细胞以103铺6孔板，待细胞融合度达到95％左 Marker，购自大连宝生物工程公 右收集细胞上清至透析袋中，用PEG6000透析浓缩， 司(TAKARA)。Trizol、DMEM培养液于粉和胎牛血 清，Invitrogen公司o 000稀释)孵育，OPD显 育，100山HP一羊抗鼠Ⅱ抗(1：1 1．1．3仪器设备核酸电泳仪、蛋白电泳仪、蛋白转 色液，2MH：SO。中止反应，酶标仪上测定0D490。 印仪，BIO—RAD公司。台式冷冻离心机，Sigma公司。