OPS法与细管法冷冻小鼠胚胎的研究.pdfVIP

OPS法与细管法冷冻小鼠胚胎的研究 1 2 2 2 * 戴建军 ，梁阳秋 ，吴悦婷 ，李 宁 ，武彩红，谢 冰，芮 荣 （南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095） 摘 要：用 0.25ml 细管和 OPS（open pulled straw）管，对小鼠囊胚进行玻璃化冷冻，以比较两 种方法的冷冻效果。结果表明，冷冻-解冻胚胎体外培养 24h后，两组的发育率分别为 63.3％（31/49） 和 71.4％（55/77）；OPS法在冻胚发育率上稍优于细管法，但无统计学差异（P0.05）；两组冷冻胚 胎的培养发育率均显著低于鲜胚培养组 94.3％的发育率（P0.05）。采用 OPS法冷冻小鼠 8-细胞胚， 其冻后培养发育率为 55.6％，似乎要低于囊胚冷冻后的培养发育率，但差异不显著（P0.05）。本 研究为 OPS法玻璃化冷冻在家畜胚胎保存上的应用奠定了基础。 关键词：小鼠；胚胎；玻璃化冷冻；OPS法；细管法 胚胎冷冻是长期保存动物种质资源的一项实用技术。胚胎冷冻技术的发展和应用减少了时间和 空间对胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活体运输所造成的疾病传播。自 Rall 和 Fahy[1] 报道玻璃化冷冻方法以来，该法因不需要昂贵的冷冻设备、操作简便、冷冻过程短，而受到广泛的 重视，得到迅速的发展。玻璃化冷冻法是利用高浓度冷冻保护剂在快速降温过程中形成的玻璃态， 有效地避免冷冻过程中有害冰晶的形成，从而使胚胎避免所受的物理性伤害；但玻璃化冷冻法所用 的高浓度冷冻保护剂对胚胎的化学毒害作用增大[2]，因此，研究者迄今仍在不断探索改进玻璃化冷 冻液和冷冻载体，如采用低毒性冷冻保护剂、多步平衡及多种冷冻保护剂联合使用等等。1997 年， Vajta 等报道，用 OPS 法（open pulled straw）玻璃化冷冻牛体外生产胚胎获得成功[3]，随后又有 多种可提高冷冻降温速度的冷冻载体被相继用于胚胎的冷冻保存，使冷冻降温速度大大提高，冷冻 损伤得以减少[4]。从总体上看，胚胎冷冻保存的方法和程序仍需要不断完善。本研究侧重比较 OPS 法和常规细管法冷冻保存小鼠胚胎的效果，以期为进一步开展家畜的胚胎冷冻保存研究提供参考。 1 材料与方法 1.1 胚胎回收 试验动物为 6～8 周龄成熟 ICR 小鼠，购自中科院上海实验动物中心，许可证号为 SCXK（沪） 2003－0003。供试小鼠分别于第 1天和第 3 天下午 4:30，腹腔注射 PMSG（孕马血清促性腺激素，天 津实验动物中心）和 hCG（人绒毛膜血清促性腺激素，宁波市激素制品厂）各 10IU作超排处理；注 射 hCG 后，将母鼠放入同品系公鼠笼内（雌雄比为 1:1 或2:1）自然交配，次日晨检查阴道栓；见栓 母鼠用于胚胎回收。于见栓后 48h从输卵管回收 8-细胞胚胎，见栓后 84h 从子宫中回收囊胚；在实 体显微镜下检卵并进行胚胎的质量鉴定，质量优良的胚胎洗 2～3 次后用于冷冻保存。 1.2 OPS 管制备 在 121℃恒温板上, 加热0.25mL 塑料细管至变软，离开加热板后两手轻拉细管使其中部拉细并 拉长至约 22cm；用刀片切除细管棉塞段，然后在 9.5cm 处的细管中间切断，即制成 OPS 管。其管壁 内径约为 0.8～1.0mm，管壁厚 0.08mm。 1.3 玻璃化冷冻 本试验所用各种冷冻液和解冻液均以 TCM199（SIGMA）＋10％NCS（新生牛血清，杭州四季青生 物工程材料有限公司）配制。玻璃化冷冻预处理液为 20％（v/v）乙二醇（EG20），玻璃化冷冻液为 基金项目：南京农业大学SRT计划（0404A03）和上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字【2003】第14－1号） 提供资助。 作者简介：1 2 戴建军（1979-），男，南京农业大学在读硕士，研究方向为动物生殖生物学。 南京农业大学动物医学院 2002级本科生。*通讯作者：南京农业大学动物医学院；E-mail ：rrui@ 。