RTPCR一步法与RTPCR两步法的比较.pdfVIP

100 福建医科大学学报　2 00 3 年 10 月　第 37 卷增 刊 RT 2P CR 一步法与R T 2P CR 两步法的比较 陈余朋, 张　声, 陈林莺, 陈　瑜, 张真真 关键词: 　逆转录聚合酶链反应; 遗传学技术 中图分类号: 　R 394　　　文献标识码: 　B 　　　文章编号: 1672 24194 (2 00 3) S020 100203 ( ) 　　R T 2PCR 是检测 RN A 模板或基因表达水平最敏感的技 TM 3000 紫外可见分光光度计 美 国B io 2R ad 公司 ; 超纯水 术之 一, 一步法 2 能克隆微量 而 不 需构建 制 备 系 统 ( 4 0 型, 德 国 公 司) ; 制冰 机 R T PCR mRN A M i ip ak M i ip o re cDN A 文库, 即 cDN A 合成与PCR 反应在同一B u ffer 及酶 中 (309 16 型, 德国Z iegg ra 公司) ; 凝胶成像分析系统(G e D O C2 ) 进行, 一步法完成, 省略了 cDN A 与 PCR 之间的过程。两 步 1000 型, 美国B io 2Ra d 公司 。 法R T 2PCR : 首先用反转录酶AM V 、M 2M u v 或 T thDN A 聚 2　方　法 合酶合 成 cDN A , 然后 以 cDN A 为模 板进行 PCR 。笔者对 R T 2PCR 一步法 与R T 2PCR 两步法进行比较, 显示 R T 2PCR 2. 1　组织总 RN A 提 取 一步法: 快速, 简便, 敏感, 减少 污染机会, 减 少了RN A 二级 2. 1. 1　组织破碎　称取组织约 50 m g 置于研钵中, 捣碎, 加 结构, 聚合酶具有校正活性, 减少 PCR 反应的错配率。R T 2 入 T rizo 1 mL 充分研磨。 PCR 两步法: 同一管中同时扩增两个 引物, 减 少了一些人为 2. 1. 2　RN A 分 离　将 混合物移入 115 mL 的 Epp en do f 管 的误差; 将 RNA 转录 为 cDN A , 易于保存; 两步法整个过程 中, 在 室温 2 0 ℃环 境中孵育 5 m in , 加入氯仿 200 mL , 剧 烈 比一步法的费用少。 振荡 15 s, 在 室温下放置 3 m in , 4 ℃ 15000 r�m in 离 心 15 m in 。混合液分为: 无色的上层水相 界面和下层红色 的酚2氯 1　材　料