SODH2O2联合测定方法.docVIP

SOD的测定 酶液提取:称取鲜叶样品。0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。 SOD： 测定SOD活性的试剂配制及用量: ①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1; ②EDTA-Na2 1mg/m1 0.2mL; ③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1; ④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1; ⑤NBT lmg/ml 0.2m1; ⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。 反应总体积为4m1, 第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应。 第2组、黑暗处理30 min。 置560nm处测定光密度。SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性: 式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。 MDA 取上清液1.5m1， 加入2.5m10.5%的硫代巴比妥酸(TBA)(用10%三氯乙酸配制)。 混合物于100℃沸水浴中加热20min，迅速冷却，于10000转/分离心20分钟，分别测定上清液在450, 532nm及600nm处的吸光度值。按以下公式计MDA浓度C( u mol/1)和含量(nmollgFW): C(u mol/1)=6.45 X (A532-A600)-0.56 X A450 Sod的测定方法 目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。二、原理SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄色），继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦、玉米、水稻(Rice)(Rice)(Rice)(Rice)、棉花等新鲜叶片2．主要仪器（1）分光光度计（2）分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管5mL数个（10）微烧杯10～15mL8个/处理（11）移液管或加样器（12）微量进样器 （13）烧杯 （14）量筒 容量瓶（16）细口瓶3.溶液的配制 （1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。（3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=81