一种参环毛蚓肠上皮细胞系及其建立方法0818.docVIP

一种参环毛蚓肠上皮细胞系及其建立方法 技术领域 本发明涉及未分化的人类 参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier) 来源于钜蚓科环毛蚓属，是《中华人民共和国药典》2010版“地龙”项下收载的4种原动物之一。因其主产于广东和广西两地，故被称为“广地龙”。由于广地龙疗效确切，药材加工精细讲究而被业内公认为品质最优。中药地龙在《中华人民共和国药典》收录品种还有栉盲环毛Pheretima pectinifera（Michaelsen）、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)以及通俗环毛蚓Pheretima vμlgaris（Chen）的干燥体，后三种习称“沪地龙”。地龙性寒、味咸，归肝、脾、膀胱经具有清热息风、通经络、平喘、利尿之功。主治高热惊痫，气虚两滞，半身不遂，肺热哮喘，小便不利及热痹等症。近20年来，国内外有关地龙的化学成分、药理作用、临床应用的研究报道相对较多。大量研究表明，地龙不仅含有丰富的营养成分，还含有多种药理活性成分，其药理作用几乎涉及人体各个系统，主要有降压、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增强免疫、抗溃疡、解热镇痛、镇静、平喘、抗菌等作用。由此可见，地龙不论作为药品还是营养保健品开发利用，在经济、社会和生态方面都有巨大的效益潜力。 目前地龙药材大多仍靠野生资源，加上不同环境条件以及采收加工技术等的影响，造成药材质量极不稳定，特别是重金属超标一直难以控制的问题。近年，在国家科技部“十五”国家重大科技攻关项目“广地龙规范化养殖研究”的资助下，我们曾随机抽取12批在我国市场上销售的广地龙药材进行了重金属含量调查，由中国广州分析测试中心的检测报告（编号2004093019）表明：其中7批次的镉（Cd2+）含量超过中华人民共和国对外贸易经济合作部发布的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中规定的限量，其超过的倍数从23倍至143倍不等。由此可见，市场上广地龙重金属超标问题令人堪忧，已严重制约其出口量和临床用药安全。参环毛蚓的重金属富集机制，制定降低或消除广地龙重金属超标建立参环毛蚓的细胞系关于蚯蚓细胞培养报道并不多，涉及到的品种是正蚓科Lumbricidae的陆正蚓 Lumbricus terrestis和赤子爱胜蚓 Eisenia foetida，且为70年代和90年代的初步尝试，距今时间较久，报道 本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的参环毛蚓肠上皮细胞系，该细胞系不仅长时间保藏成活率高，而且在传代培养时仍然表现出快速分裂增长的活性。 本发明解决上述问题的技术解决方案是： 一种参环毛蚓肠上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为CCTCC —C201294。 上述参环毛蚓肠上皮细胞系的建立方法由以下步骤组成： （1）将收集野外采集温度置于垫有用蒸馏水湿润的滤纸烧杯中，保持适宜的，每天换滤纸1次，吐泥34 天； （2）取吐泥34 天后的参环毛蚓于超净台上，用75%酒精体表消毒后解剖将的肠道部位用LBSS缓冲液冲洗，用抗生素组合液灭菌min；弃抗生素组合液得到的肠道部分先加入体积为肠道体积的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后弃去酶解液，再加入体积为肠道体积的10倍的Collagenase Type I酶解液酶解20分钟，过100目的细胞篩除去较大的组织碎片，然后以1000 r/min离心min，弃上清，收集细胞；其中， 所述的抗生素组合液青霉素钠硫酸链霉素硫酸庆大霉素抗生素组合液青霉素钠200 U/ml，硫酸链霉素400μg/ml，硫酸庆大霉素300 U/ml ，两性霉素B5μg/ml； 所述的Thermolysin酶解液是将Thermolysin粉末加入到浓度为10m mol/ml的HEPES溶液中过滤灭菌混合制成，所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的浓度为25μg/mL； 所述的Collagenase Type I的酶解液是将Collagenase Type I粉末加入到不含Ca2+、Mg2+的HBSS（1 x ）溶液中过滤灭菌而成，所制的Collagenase Type I酶解液中Collagenase Type I的浓度为0.2mg/mL； （3）往收集的细胞中加入培养液调整细胞密度为1 x105/ml接种于透气培养瓶中，置于28℃，5%CO2培养箱中培养 U/ml的硫酸庆大霉素青霉素钠硫酸链霉素两性霉素Bμg/ml； 所述的青霉素钠青霉素钠青霉素钠U/ml； 所述的硫酸链霉素硫酸链霉素硫酸链霉素00μg/ml； 所述的两性霉素B两性霉素B两性霉素B5000μg/ml； （4）然后，刮下上皮样细胞克隆区域以外的细胞群，再往培养瓶加入传代培养液淹没贴壁面的细胞继续培养，直到上皮样细胞克隆区域达到85%以上，即得到所述的参