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第三章林木分子标记技术 本章要点 3.1 分子标记的种类 3.2 分子标记分析技术 3.3 分子标记技术在林木中的应用 3.1 分子遗传标记的种类 3.1.1 遗传标记 （1）概念 遗传标记（genetic marker）：可以稳定遗传的、易于识别的、特殊的遗传多态性形式。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异（差异）。 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上相对差异或者是DNA序列的差异。 3.1.1 遗传标记 （2）种类 遗传标记包括4大类： 形态标记（morphological marker） 细胞学标记（cytological marker） 生化标记（biochemical marker） DNA分子标记（molecular marker） 形态标记 能够用肉眼明确观察的一类外观特征性状，如植株高矮、花色等。 广义上讲，还包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的性状。 简单直观，经济方便，容易观察记载。 缺点：数量少，可鉴别标记基因有限，许多形态标记还受环境、生长发育期等因素的影响。 细胞学标记 能明确显示遗传多样性的细胞学特征。染色体数目和结构的变异。 染色体结构特征包括染色体核型和带型。 缺点： - 标记材料需要大量的人力和较长的时间来鉴定培育； - 某些染色体结构和数目变异的材料难以保存； - 一些不涉及染色体数目和结构变异的性状，难以用细胞学方法检测； - 可利用的细胞学标记很少。 生化标记 主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记。 同工酶是一种良好遗传标记，在过去20多年中得到了广泛的发展与应用。 同工酶标记优于形态学标记和细胞学标记。但同工酶检测的位点仍然较少，且同工酶具有发育和组织特异性，其应用有限。 DNA分子标记 是DNA水平上的遗传多样性，简称分子标记。 指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 多以电泳谱带的形式表现生物个体间DNA差异。 DNA分子标记 与前面3类遗传标记相比，分子标记有以下优越性： 直接以DNA形式表现，在植物体各组织、各发育期均可检测到，且不受环境限制，不存在是否表达的问题； 数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限； 多态性高； 表现为中性，即不影响目标性状的表达； 一些分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯和基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。 3.1.2 分子遗传标记的种类 研究始于1980年，现已有数十种。可归为3类： 基于分子杂交技术的分子标记（有RFLP） 基于PCR技术的分子标记（如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SCAR、CAPs、STS、） 基于DNA芯片技术的分子标记（SNP） （1）RFLP 即限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism) 基本原理: - 利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA片段数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。 - 通过凝胶电泳分离这些片段，就形成不同带，然后与DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。 （1）RFLP 反映了基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上差异。 由于不同个体之间在等位基因碱基的替换、重排、缺失等变化，导致限制性内切酶识别和酶切发生改变，从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 共显性。 RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的位点数为1－4个。 不足之处： - 克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难 - 实验操作较繁锁 - 检测周期长 - 费用高 （2）RAPD 即随机扩增多态性DNA （Random Amplified Polymorphism DNA） 由Williams和Welsh于1990年同时创立。 基本原理： 利用随机引物(一般10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性，以反映基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点。 一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。 利用一系列引物可使检测区域扩大到整个基因组。 因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 是显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子。 快速、简便、高效、成本低、DNA样品用量少。 稳定性和重复性较差，但可通过控制实验条件