单启动子双表达载体pIRESp14ARFp53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用.pdfVIP

·473· ·实验研究· 单启动子双表达载体pIRES—p14ARF—p53的 构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用 李进杨述华邹利军邵增务廖翔 【摘要】 目的构建双质粒表达载体pI砌强·p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的 抑制作用。方法利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系【02细胞中扩增出的p14cDNA (O．5kb)亚克隆至pIlu药载体中，通过聚合酶链反应(PcR)、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒 pIREs—p14ARF—p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG_63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞 仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录(RT)．PCR和Westemb01t对稳定转染后的瘤细胞 p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞 增殖情况。结果成功构建出双质粒表达载体pI硒§-p14ARF—p53。转染后瘤细胞形态由转染前 密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间 比转染前增加了2．3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞 多停滞于GI期；RT-PcR与w∞temblot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分 别有独立表达，转染MG彤后24、48、72、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33．43％、69．37％、 66．19％、75．26％，差异有统计学意义(P0．01)。结论野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细 胞的增殖促进瘤细胞的凋亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了 基础。 【关键词】骨肉瘤；启动子；脱噬作用；基因治疗 Co璐tmction ofthe bicistIⅫ吐cshIl戗IevecIor勰dits and甑pressiona鼹By pI砌嚼·p14ARF-p53 em斌on of螂tr嘲r∞mcelk pm胁髓tion 口且玮，l驯GS^”．^∞，ZO(，确‘珏，eo以．风粥疗mem 矿0疗如P耐池，un西n目的，涮，而，l硝旭目d记亩co魄萨，胁娥舭I增功啦们蚵旷访，聊口以死曲，10如gy， 慨讹n comtnlctthe bici8t唧1icshunlevecIor 430022，chi衄IAbst髓ct】Objecti僧’ro p14^RF／p53 朗d its e珏如t8onthe ofthecarcino瑚cells．Methods sttldyinhibitory prol渝ration觚dgrwth p14ARF ID2cells 回NAw鹊cloned如mb瑚i职R1’-PCRmethod跚dp14ARF锄d茚3nmle嘲hcDNACDS were8ubclonedinto8hutde inorder I七coInbiMtion vI戈“”pIItES by霉rene technoloP胃afterc们批dysecnlen． constlllctionwasidentified chain re8tri甜on ciI壕．Plasmid byploymera8are且ction(PCR)combined诮th recombi聃ntwast踟sferredintoost∞8arcomace：n 咖zymedi学e8ti∞andBeqtlence砌y8is．Thepk8mid HneMG-3 bylipfectanline20()o．andthe硝istantclone8we珊8electedby(洱18∞lcctivemedj哪．now wasusedtodete瑚iI地thecontemofDNAaIldceU and in08_ clrtometry