家蚕消化管特异表达的金属羧肽酶基因发掘及其功能的研究.pdfVIP

家蚕消化管特异表达的金属羧肽酶基因发掘及功能研究 徐俊 a,b,, 龙菲菲 a,b, , 甘丽萍 a,b, 司马杨虎a,b,c, 徐世清 a,b,c* a b c 苏州大学农业生物技术与生态研究院，苏州 215123 ； 苏州大学医学部，苏州 215123 ； 现代丝 绸国家工程实验室, 苏州 215123. *通讯作者 E-mail: szsqxu@suda.edu.cn. 共同第一作者 摘要：金属羧肽酶（mCPs ）是家蚕等昆虫消化管中参与饲料蛋白质消化吸收的关键酶。本文利用 构建的家蚕消化管 SAGE 表达文库的特异性表达标签 Tag （AAATAAAAACTCTATTC ），发掘到家 蚕 EST 序列 BY926338 ，进一步克隆了一条消化管特异表达的金属羧肽酶基因（mCpA ），调查了 饥饿和饲料蛋白含量，高温和昆虫激素处理，以及 mCp 基因敲降，对 mCp 基因表达的影响，鉴定 了解克隆的mCp 基因及蛋白质产物对家蚕蛋白质营养消化吸收和家蚕生长发育的影响。 关键词：家蚕；表达谱；金属羧肽酶基因 项目资助：江苏省科技支撑计划项目（No. BE2011327 ），国家 863 重大主题项目课题（项目编号： 2011AA100306 ） 羧肽酶（CPs ）是一类肽链端解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸。根据其催化 机制分为 3 个亚类：丝氨酸羧肽酶（serine carboxy peptide enzymes ）（编号：EC 3.4.16.- ）、金属羧 肽酶（metallocarboxypeptidase ）（编号：EC 3.4.17.- ）和半胱氨酸羧肽酶（cysteine carboxy peptide enzymes ）（编号：EC 3.4.18.- ）（Skidgel RA, et al., 1998)。 昆虫的金属羧肽酶（metallocarboxypeptidase ，mCP ），在不同的组织器官中发挥着许多重要的 功能，从食物的消化到神经内分泌肽的合成，均离不开 mCP 的作用（Barrett et al., 1998）。在昆虫 生长发育中，mCP 主要参与多肽和蛋白质的加工。根据结构域及氨基酸序列相似性的差异，mCP 可分为 2 个亚家族，第一亚族是与消化食物有关的 mCP （A1 、A2 、B ），该家族成员N2 端均含有 一段 90AA 左右的前肽，它对酶体（enzyme moiety ）有一定的保护和抑制作用。mCPA/B 亚家族 已经在昆虫中得到证实，棉铃虫（Helicoverpa armigera ）（Bown et al., 1998）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae ）（Edwards et al., 1997）、埃及伊蚊 （Aedes Aegypti ）（Edwards et al., 2000）、拟舌蝇 （Glossinia morsitans ）（Yan et al., 2002）、Mamestra configurata （Hegedus et al., 2003）中都已有相关的研究。 第二亚族包括脑呔啡转化酶羧肽酶 E （Fricker 1988 ），mCPE 从神经内分泌前体中移除赖氨酸和精 氨酸；以及羧肽酶 D （Walter et al., 1996），mCPD 在着色和翅膀形成相关的邻苯二酚胺新陈代谢中 起重要作用。mCPN/E 亚族的 N2 端不含或仅含一段较小的前肽（16AA，在 CPE 中），除了二者共 有的信号肽和酶体外，后者还含有一些 mCPA/B 中没有的其它结构域（Skidgel et al., 1998; Wei et al., 2002 ）。 Ward （1976）从衣蛾（Tineola bisselliella）的消化管中发现了羧肽酶的活性，这是首次在昆虫 中肠中发现的消化性羧肽酶mCPA/B 。随后，在鞘翅目昆虫黄粉虫 （Tenebrio molitor）（Ferreira et al,   303 1990）和鳞翅目昆虫草地夜蛾（Spodoptera frugiperda ）（Ferreira et al., 1994；Bown et al.,1998）也 发