用人造微小染色体技术研究着丝粒和端粒的DNA结构与功能).pdfVIP

遗传 HEREDITAS (Beijing) 8(6)：1一41986 综 用人造微小染色体技术研究着丝粒和端粒的 述 DNA结构与功能，‘ 潘 准’ 钩 北（京大学生物系） 为了在细胞世代中保持其稳定性，染色体起码应 推论酵母基因组中其他的复制起点 A（RS）与 ARSI 具备3个结构要素，那就是有一个DNA复制起点；一 序列相差甚远。这也许就是各复制起点不同步启动的 个着丝粒 (centromere）使细胞分裂时两个姊妹染色单 分子基础之一。 体能平均分配到子细胞里；最后，在染色体的两个末端 必须有端粒 (teloxnere)，使 DNA能完成复制。近年 二、 着 丝 粒 来人们采用分子克隆技术把真核细咆染色体的复制起 上述插有ARS1的质粒虽然能在酵母细胞中复制 点、着丝粒和端粒的 DNA片段分别克隆成功。 并且 和表达，但它和正常染色体的根本区别在于没有着丝 把它们互相搭配或改造而构成所谓“人造微小染色体” 粒。因此在有丝分裂时它不能被均等地分配到两个子 (artificialminichromosornes),以研究这3种成分的结 细胞中去。酵母是以“出芽”方式分裂的，复制后的两 构与功能。 个 ARS1质粒总爱留在 “母”细胞中，往往不进入 “子” ’’（芽”）细胞。这样，经过若干个细胞世代，“母”细胞中 一、染色体复制起点 ARS质粒拷贝数逐渐积累以至多达50个拷贝，同时整 大肠杆菌质粒 PBR322不能转化酵母细胞，因为 个群体中不含质粒的 trp一细胞比例迅速增加。 PBR322上的DNA复制起点不能被酵母系统所识别， 于是上述两个实验室又进一步设法把酵母染色体 DNA不能复制。 1979年 Stinchcombs’和 Carbon 上的着丝粒DNA序列插入这个ARS1质粒中Ls,7,14,1470 实验室分别把带有遗传标记，例如 Tr广 的酵母 DNA 由于人们已经积累了十分详尽的酵母遗传学资料，在 的 ＆oRI片段插入 PBR322，用来转化 up 酵母，获 许多染色体的着丝粒附近都标明了可供筛选的标记基 得了带有质粒并能传代的 Trp＋细胞。它们所含的质 因。以这些基因为靶子，就可把有关的着丝粒 DNA 粒比PBR322多出1.4kb，若把这 1.4kb片段用EcoRI 片段克隆出来。例如染色体 川 上紧挨着丝粒有个 重新切下，颠倒过来接回PBR322，仍然能使 trp一酵 CDC10基因，它是温度敏感突变基因 cdc10，的等 母转化成Trp十酵母。其他外源 DNA或基因若与这 位基因。用上述ARS1质粒克隆CDC10基因片段，由 1.4kb片段相接并插入 PBR322，便能在酵母中复制、 此重组的质粒转化cdc10突变株后，在37℃培养便一可 表达和传代。例如，接上含有 his3和 DNA片段后就 筛选出含 CDC10的转化子。 凡擂入了CDC10基因 能使his一细胞转化成 Hiss等等。可见这 1.4k6片段 的质粒在酵母细胞中的行为便类似于正常染色体了。 包含了Trp+基因和一个酵母染色休的复制起点，后 在有丝分裂后 “母”、“子”两个细胞各得一个质粒拷贝。 者被称为 ARS1,即能够起始染色体复制的DNA.序 可见染色体III的着丝粒DNA片段 命（名为CEN3）也 列。这样的ARS1-PBR322环状质粒由于兼含酵母和 随着CDC1。基因一起插人了这质粒，使之在有丝分裂 大肠杆菌系统的两种复制起点，因此成为既能在酵母 时能够 “挂”到纺锤微管上去，从而被均等分配。 细胞也能在大肠杆菌中进行复制和传代