葡萄糖异构酶突变体酶GIG138P和GIG138PG247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测.pdfVIP

1 期 朱国萍等：葡萄糖异构酶突变体酶:;:91$I 和:;:91$IC:3(! 在变铅青链霉菌中的高效表达及检测 1)’ !# 方法 $% = ; 酶切，分别获得含有 :91$I 单点突变和 重组穿梭表达载体的构建： 酶切、回收、 双点突变的 的 结构基因，与 !# ! !# :91$IC:3(! 9?3 XY ’( 连接和转化参照文献［］进行。 经 和 酶切的 链霉菌穿梭载体 $ !# ; $% = ; ) L *+,-C !# # 基因的诱导表达：分别将%’( 和重组菌株 =W933 约 9) ?3 XY 的大片段连接，转化 ) L *+,- 的链霉菌孢子接种于 含有卡那霉素（ ） ，构建了表达载体 和 ，如图 。 ’)*+ ’ ,-*+ !=’# =WC:;9 =WC:;3 9 ! 的./0/ 培养基中，于1) 2摇床振荡培养（转速3)) 用!# ; 和 $% = ; 酶切鉴定，穿梭表达载体 =WC ） 后，加入 的 ，继续 培养 和 已构建成功。再用 或（和） 4-*56 3( 7 3 ,-*+ %7 1) 2 :;9 =WC:;3 !+. ; $/, ! ［］ （诱导表达 ）。 ( 18 7 93 7 ; 酶切鉴定定点突变 ，证实=WC:;9 和=WC:;3 确 !# $ :; 粗酶液的制备：将’) *+ 培养物离心收集 实含有所需的突变位点（图略）。 菌体，用 破碎缓冲液（ ）｛ 9)*+ = ?’ ’) **@A- + %45BC ， （ ）， ｝洗 =DA 9) **@A- + /!%# =$?) 9)) **@A- + 0,DA3 涤菌体 次，称取湿重 的菌体，悬浮于冰预冷的 1 9, 3 破碎缓冲液中，冰浴超声破碎 ， E 1*+ 9’ E 3) *56 93 )))4-*56 离心收集上清，此即胞内粗酶液。 酶活力测定：以 葡萄糖或 木糖为底物 !# % !C !C ［］ F 采用改进的乙醇 咔唑法 。 C !# 酶蛋白含量的测定：采用+@G4H 法，以牛血清 ［］ 白蛋白为标准1 。 抗血清的制备：将纯 与 、完全福氏 !# ’ :; :; IJK 佐剂用搅拌器打匀成乳化剂，对 只 个月大小的 1 3 白色健康家兔进行腹部皮下注射，一次 只兔子注