植物甜蛋白despGlulbrazzein在大肠杆菌中表达条件的优化.pdfVIP

■圈譬图翟霍■璺Q塑垒塑坚垦堕型!Q堕!塑堕里堕f 李春丽1 陈其新1，2 何国庆3 3(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州，310019) 摘 要 IPlrG浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示，温度是重要的影响因素。进一步 的研究表明，菌株在28～30℃以0．2mmol九IPTG诱导4h，对菌株生长和目的蛋白的表达有利，目的蛋白的表 达可达到总蛋白的43．8％。 关键词植物甜蛋白，大肠杆菌，高效表达，优化 基均为LB培养基。 Brazzein(巴西甜)是Ming等从西非植物 6m名黝2砚口Baillion的果实中分离得1．2实验方法 R扎缸以痧缸咒dm 到的一种甜蛋白，由54个氨基酸组成，分子质量为 1．2．1表达菌株的检测和诱导 6．5ku，该蛋白甜度极高，以分子质量为基础进行比 较，其甜度是蔗糖甜度的2000倍；以质量为基础进 plysS，提取重组质粒进行酶切检测，进一步进行测序 行比较，其甜度是蔗糖甜度的500倍L1’2j。Brazzein 检测。严格参照分子克隆实验操作进行诱导表 对热和pH有较宽耐受范围，80℃处理4h仍保持完达L5 整活性。Brazzein有1个由53个氨基酸组成的异构 果，蛋白活性的检测采用品尝的方法H]，通过与蔗糖 体(仅仅缺乏第1个焦谷氨基酸，称为如一pGlul— 甜度的比较，确定其甜度。 Brazzein)，其甜度更高，是Brazzein的2倍心’3]，是目 1．2．2菌种活化和培养 前为止所发现甜蛋白中分子质量最小、水溶性最好、 甜度最高的蛋白，具有独特的研究和开发价值。虽然 的LB固体培养基平板上培养过夜，取单菌落接种于 如一pGlul—Brazzein具有较为广阔的潜在应用前 mL 含50 LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃ 景，但是由于受到资源、产地的限制，难以从正常的植 250 物组织中大量分离纯化得到，又缺乏切实可行的替代 种量接入含100 途径，从而限制了其应用。我们按照细菌密码子的偏 进行培养和诱导。 爱优化了des—pGlul_Brazzein的编码序列，并构建 1．2．3 其表达载体pET—Br乜，在大肠杆菌BL21中得到了 白的条件选择 表达，但是表达量较低L4J，在此基础上，采用严紧控 制型菌株BL21(DE3)plysS作为表达菌株，使d舀一 pGlu卜Brazzein得到了高效表达，并对其诱导表达条 诱导表达，终浓度分别为0．2mmol／L、0．4mmol／L、 件进行了优化。 0．5 mrnol／ mmol／L、0．6mnlol／L、0．8mmol／L和1 h和6 1 材料与方法 L，在4 h分别取样进行生物量测定和SDS— PAGE电泳分析，每个实验重复2次，求平均值并进 1．1 实验材料