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特异性1023脱氧核酶对肝癌相关基因IGFⅡmRNA的体外切割作用.pdf
·2798· 生国羞生堂基盛垫!Q生!Q旦箍!Q鲞
特异性10．23脱氧核酶对肝癌相关基因IGF一ⅡmRNA的体外切割作用
刘雁飞 罗速赵锐(北华大学基础医学院，吉林吉林132001)
DR丑。DR妇和AsODN均未显示出切割活性。结论筛选出的活性DRzl可进一步的用于细胞内实验。
[关键词】原发性肝细胞肝癌；基因治疗；胰岛素样生长因子Ⅱ；脱氧核酶
(中圈分类号】IH35．7(文献标识码】A [文章编号】IO帖税吆(加lOIl9-27粥J略
人胰岛素样生长因子Ⅱ(i璐ulin．1ikeg哪vtllfllctor-Ⅱ，IGF一 以R1为特异性引物，以提取的总RNA为模板合成cDNA，
Ⅱ)是IGFs基因家族成员之一，是调节人和胚胎发育必需的生反应条件为42℃，60min，99℃5min灭活AMV，5℃5“n。取
长因子，肝脏是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官。研究表明，
lGF-Ⅱ与肝癌的发生发展密切相关，多种肝癌细胞株可以通过 条件为94℃预变性10IIlin，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃
自分泌或旁分泌IGF-Ⅱ的方式调节其自身和转移灶的生延伸30s扩增30个循环，72℃延伸10min。PcR产物用2％琼
长¨订】，因此可将IGF．Ⅱ作为肝癌基因治疗的潜在靶点。10·脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色观察结果。以F和R为引物，
23脱氧核酶(deox州bozyInes，D舭)是具有RNA切割功能的单PcR产物为模板，进行二次PcR扩增，反应条件同上。
链DNA分子，通过两边的底物结合臂与靶mRNA特异性结合1．2．3重组质粒的构建及鉴定将第二轮PcR回收产物和
后，对靶mMRA具有高效、特异的切割作用，从而可以在mRNA I和HindⅢ37℃酶切4
PGEM．3Z质粒用EcoR h，切胶回收目
水平E抑制基因的表达，达到基因治疗的目的。本研究共设计 的片段，16℃水浴反应60
3条针对IGF·ⅡmRNA的DR卫，观察其在体外对靶mRNA的切
方法按分子克隆实验指南操作。挑取阳性克隆进行双酶切鉴
割作用，探讨脱氧核酶在肝癌基因治疗方面的应用前景。 定后进行测序。
1．2．4IGF．ⅡmRNA的获取抽提纯化重组质粒PGEM_3z—
l材料与方法 IGF．Ⅱ，用HindⅢ将质粒进行单酶切，使之线性化后用r17体
1．1 材料HepG2肝癌细胞由长春肿瘤研究所提供，PGEM一
外转录试剂盒获取IGF-ⅡmRNA，步骤参照说明书进行。
3z质粒、JMl09菌株和r17体外转录试剂盒均购自Pmmega公
1．2．5不同位点10．23DRz对靶RNA的切割反应首先采用
司，RT—PCR试剂盒、DNA连接试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、
RNA
质粒DNA小量纯化试剂盒、％zol试剂、核酸内切酶EcoRI和 针对ICF．ⅡmRNA的起始区和编码区的保守位点分别设计脱
HindⅢ均购自Tak啪公司。 氧核酶DRzl、DR也和DRz3作为对照，设计针对相同底物的
1．2方法 7-GAlTI℃一
17nt的反义寡聚脱氧核苷酸(As0DN)。DRzl：5
5’一CACCAG—
1．2．1 细胞总RNA的提取用含有10％血清的培养液培养 CCAGGCTAGCTACAACGATGGTGl℃T．3’：DRz2：
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