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抗体制备protocol 1. 小量诱导表达 先小量过夜培养5ml菌，次日转加1ml到25ml LB 中，加上抗生素卡那霉素至 终浓度50ug/ml，37℃，200r/min，摇至对数期：OD600=0.5 左右；取出1ml 菌 液，冻于—20 ℃；在剩余菌液中加入IPTG(MW:238.3) 至终浓度为0.4mM ；37℃ 继续摇； 以后每隔1h 即取出1ml 冻于—20 ℃，直至6h 。把上述菌液融化，12，000g，1min， 弃上清；加入50ul 2*SDS sample buffer 悬浮沉淀；12，000g，1min 。取25ul 上 样，跑15% SDS-Urea，检测（图6 ）。 图 6. 小量诱导表达 IPTG 0.4mM 0h, 1h,2h,4h, 6h .SDS-Urea(15%),IB 为包含体。 2. 大量表达 1、过夜培养50ml 菌液。 2 、次日把过夜培养菌液全部加入到1.5L LB培养基中，加上抗生素，37℃， 200r/min，摇至对数期。OD600=0.4 3、加入IPTG 至终浓度为0.4mM ； 4 、37℃，诱导一定时间（最佳条件）后，冰上放置。 5、4℃，5000g，15min，收集细菌，弃上清； 6、按每100ml 菌液加入4ml Binding buffer （—urea ）悬浮沉淀； 7、加入Lysosome 至终浓度1mg/ml；室温30min ；4 ℃摇床10min； 8、加入Triton X-100 至终浓度1%；4 ℃摇床10min； 9、超声波冰上破碎约10min （10s 超，10s 冰上放置）； 10、4 ℃，3000g，30min，上清另存用于检测； 11、用若干Binding buffer （—urea ）悬浮沉淀，洗涤可溶性杂蛋白； 12 、4 ℃，3000g，30min，上清另存用于检测； 13、沉淀溶于Binding buffer （+urea ）中（按每100ml 菌液加入4ml ）； 14 、取少量检测，15% SDS；其余冻存，用于纯化； 3. 蛋白纯化 1、0.45um 滤器过滤蛋白样品； 2 、蛋白定量：考马斯亮蓝法 3、柱层析 把柱子填料50% 的Ni-Resin混匀，取2ml ，均匀加入到柱子中，柱子填料 自然沉降后得到V=1ml 的柱子，3V 无菌水冲洗，3V Binding buffer （+urea ）平 衡。 依次取下述样品or 溶液过柱，并依次收集各部分样品 取约10-15mg 的蛋白样品（0.45um 过滤），速度为10 V/hour； 6V Binding buffer 洗柱； 4V Washing buffer （+urea ）洗柱； 6V 10mM 咪唑Washing buf （+urea ）洗柱； 6V 50mM咪唑Washing buf （+urea ）洗柱； 6V 100mM 咪唑Washing buf （+urea ）洗柱； 6V 150mM 咪唑Washing buf （+urea ）洗柱； 6V 200mM 咪唑Washing buf （+urea ）洗柱； 5V 无菌水冲洗； 3V Binding buffer （+urea ）平衡； 加入2V Binding buffer （+urea ），保存于4 ℃。 取不同咪唑Washing buf 洗脱后的收集物跑胶检测。结果发现洗脱产物主要 集中在含50mM咪唑Washing buf和100mM咪唑Washing buf 的洗脱后的收集物中 (图7)。 图7 图8 4. 透析 剪下10cm 长的膜，在蒸馏水中浸泡15min；移入500 ml的处理液中，加热 至80℃以上，约30min ；用80℃以上温度的水洗30min ；换至20% 的酒精中，4 ℃ 冰箱保存； 处理好的透析袋用干净绳子把一头绑紧，无菌水漂