答案分子生物学作业一.docVIP

《分子生物学》作业 第2-4章/第8章 什么是SNP？试述研究SNP的意义。 ORF ? 调节基因 ? 请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。 ? 简述酵母双杂交技术的原理。 分子克隆技术包括哪些基本步骤？目的基因和载体连接主要有哪些方法？ 简述分子克隆中常用的工具酶ORF（Open reading frame）开放阅读框基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断具有调节其他基因性状功能的基因，称为调节基因。包括决定阻抑物、阻抑物蛋白、其他环状AMP受容蛋白质等控制性物质结构的基因、阻抑物作用部位的操纵基因、RNA多聚酶以及它的促进物质的作用部位启动区等等。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。’→3’聚合酶活性；（2）3’→5’核酸外切酶活性；（3）5’→3’核酸外切酶活性。 反转录酶作用：（1）反转录作用；（2）核酸酶H的水解作用；（3）依赖DNA的DNA聚合酶作用。 DNA连接酶作用：主要是催化两个互补黏性末端或平末端的两条双链DNA分子的5’磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同黏性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。 碱性磷酸酶作用：（1）除去DNA片段上的5’磷酸，以防自身连接；（2）在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5’端的磷酸。 多核苷酸激酶作用：催化核酸分子末端磷酸化的酶类。如T4多核苷酸激酶，可通过磷酸化或磷交换的方式，将ATP分子5’位的磷酸基团转移到DNA或RNA的5’端。’末端加上互补的同质多聚尾，形成人工黏性末端，便于DNA重组连接；（2）用于DNA 3’末端的同 位素探针标记。 8.载体具备要素：1. 能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般 10Kb。2. 带有遗传筛选标记。3有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。. 双抗生素筛选原理：某些质粒载体如pBR322质粒中具有Amp和Tet抗性基因，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列（在Tetr基因序列内）时，则此质粒由Tetr变为Tets。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能生长的细菌只是含有空载体，从而筛选出含有目的基因的工程菌。 蓝白斑筛选的原理：某些质粒载体带有lacZ’基因，该基因编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸，IPTG可诱导lacZ’基因的表达而生成α-肽，其能与宿主细胞所编码的缺陷性β-半乳糖苷酶实现所谓的α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶活力。该酶能催化X-gal形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ’基因中的MCS时，lac α-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，从而可以将其筛选出来。 9.常用探针标记物有：32P、35S、3H、131I、125I、生物素、地高辛、辣根过氧化物酶、荧光素及光敏生物素等。 探针的标记方法有：（1）缺口翻译法或切口平移法；（2）随机引物法；（3）末端标记法；（4）反转录标记法；（5）化学修饰标记法；（6）酶促反应标记法。 10.影响核酸分子杂交的因素有：（1）核酸分子的浓度与长度；（2）温度；（3）离子强度；（4）甲酰胺；（5）核酸分子的复杂性；（6）非特异性杂交反应等。杂交条件的优化涉及到：（1）探针的选择；（2）探针的标记方法；（3）探针的浓度；（4）杂交最适温度；（5）杂交反应时间；（6）洗膜温度；（7）杂交液的优化。 1