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管圆线虫胶原蛋白基因的测序与表达 生命科学学院08级3班吴星星 一．胶原蛋白介绍 胶原蛋白又名胶原质, 是由动物细胞合成的一种生物性高分子, 是构成动物结缔组织的 主要蛋白 质, 广泛存在于骨、腱、软骨、皮肤等结缔组织中,在脊椎动物中约占总蛋白的1/3。 最常见的3 种胶 原是Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原, 其中Ⅰ型胶原是成年动物皮中的主要胶原形 式。胶原蛋白中脯氨酸和羟 脯氨酸的含量是各种胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高的蛋白 质, 起着支撑器官、保护机体的作用。近年来, 随着胶原蛋白提取技术的发展和其结构、性 质等的深入研究, 其水解产物和多肽的生物功能也逐渐被广泛认识, 胶原蛋白的应用成为生 物、医学、食品、化妆品等领域一具新的研究热点。本文胶原蛋白又名胶原质, 是由动物细 胞合成的一种生物性高分子, 是构成动物结缔组织的主要蛋白 质, 广泛存在于骨、腱、软骨、 皮肤等结缔组织中,在脊椎动物中约占总蛋白的1/3。最常见的3 种胶 原是Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ 型胶原, 其中Ⅰ型胶原是成年动物皮中的主要胶原形式。胶原蛋白中脯氨酸和羟 脯氨酸的 含量是各种胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高的蛋白质, 起着支撑器官、保护机体的作用。 近年来, 随着胶原蛋白提取技术的发展和其结构、性质等的深入研究, 其水解产物和多肽的 生物功能也逐渐被广泛认识, 胶原蛋白的应用成为生物、医学、食品、化妆品等领域一具新 的研究热点。概述了胶原蛋白的组成和结构特点, 并详细介绍了胶原蛋白在功能保健食品、 食品添加剂、食品包装材料等食品领域中的广泛应用蛋白质中含量最高的[1]。蛋白质是一 切生命体必不可少的组成部分, 胶原作为一 大类蛋白质, 在生物体内起着重要作用。由于胶 原蛋白有诸多优良性质, 使这类生物高分子化合物 用途非常广泛, 遍及医药、化工、食品等 领域[2]。胶原蛋白具有巨大的开发潜力和利用价值。随着科 学技术的发展, 人们对胶原的 应用越来越广泛, 对胶原蛋白的需求越来越大, 如何既经济又快速获得 胶原蛋白已成为人 们关注的课题。 一实验材料介绍 广州管圆线虫病( Angiostrongyliasis) 是由广州管圆线虫 (Angiostrongylus cantonensis) 幼虫寄生于人体中枢神经系统而引发的疾病。人感染广州管圆 线虫后, 幼虫在人体内移行, 侵犯中枢神经系统, 引起脑组织病变。患者出现嗜酸性粒细胞 增多性脑膜脑炎或脑膜炎。临 床症状主要为急性剧烈头痛; 其次为恶心、呕吐、发热及颈 项强直; 严重病例可有瘫痪、嗜 睡、昏迷, 甚至死亡作为一种新发传染病的病原, 广州管圆 线虫的许多生物学特性, 特别是 分子生物学方面, 还未被人们所认知。鉴于广州管圆线虫在 人体的感染和致病阶段主要为幼 虫, 本实验根据广州管圆线虫幼虫的cDNA 文库表达序列 标签( expression sequence tag, EST) 测序结果, 采用PCR 技术克隆并鉴定了广州管圆线虫 胶原蛋白(collagen, COL) 基因 的全长cDNA 序列, 并构建了其原核表达重组质粒, 为下一 步的深入研究奠定了基础。 二．胶原蛋白的提取 1.1 实验原料 广州光源线虫 1.2 仪器设备 Beckman LG10 - 2.4A 冷冻离心机; Unico UV-2102 紫外分光光度计;ALPHAL-2 冻干 机; DYY-Ⅲ 电泳仪:; 自动定氮仪:KTJELTEC, Auto1030Analyzer; 835-50 型氨基酸分析 仪:; WR-2001 溶剂过滤器: 1.3 试剂材料 胃蛋 白酶、胰酶:,三氯乙酸, 对二甲氨基苯甲醛, 氯氨T, 高氯酸, 巯基乙醇, 柠檬酸缓冲液 等。 所有试剂均为分析纯;超滤膜:TS- 100,CXA- 50, 实验方法 1.4.1 酶法提取胶原蛋白本实验 选用胰酶、胃蛋白酶进行酶解, 提取管园线虫的胶原蛋白。 按 原料∶缓冲液(pH8~9)1∶3 匀浆, 加入胰酶搅拌均匀, 在45℃酶解4h, 沸水浴灭酶 10min,5000r/min 离心15min, 取上 清液, 将上清液冷冻干燥保存。去脂去杂蛋白的线虫, 按 原料∶缓冲液(pH2)1∶7 匀浆, 加 入胃蛋白酶搅拌均匀, 在37℃酶解6h,沸水浴灭酶10min, 7000r/min 离心15min, 取上清液, 将上清液冷冻干燥保存。补充：酶法提取胶原蛋白具体原理 胶原蛋白是由三股螺旋组成的, 分子量在30 万u,每条肽链的分子量大约为10 万u。 因胶原蛋 白酶对胶原蛋白的水解主 要破坏胶原的