3细胞凋亡与增殖的原位检测120227.pptVIP

测定时以组织中的静息淋巴细胞DNA含量为二倍体对照。与所测细胞比较，就可测出DNA含量不同的增生细胞的比例。 4.嗜银核仁组织区法 NORs含有核糖体基因和一些对银有高亲和性的酸性蛋白质。简单的一步银染法即可显示NORs。光镜下， NORs为的黑色小点．多数直径约0.5—1um，位于核内，也可见于分裂细胞的染色体上。 AgNOR AgNORs计数方法 人工光镜观察组织切片时应计数至少100个细胞，而观察涂片为50个细胞。如用全自动图像分析仪计算机计数，可计数数百或更多细胞。最后将结果表示为单位细胞核的AgNORs颗粒数。研究资料表明，除AgNORs颗粒数外，其形态分类及分布部位在良恶性肿瘤的鉴别中也有应用价值。 应特别注意计数区域的选择应有良好的随机性。 测定细胞增生活性方法间的关系及其选用 原位测定细胞增生活性要求方法简单、经济、重复性好、能常规使用，结果容易判断。以此为标准，核分裂像计数、免疫组织（或细胞）化学及AgNORs都有各自的优点。 feulgen染色与流式细胞术相比，不需要将组织制成细胞悬液，所测得的增生活性更能反映组织原位的本来面貌。 原位测定细胞增生活性所测的结果都可定量表示，大大避免了主观因素的影响，成为定量病理学的重要组成部分。 各种方法相关性的比较研究表明核分裂像计数、Ki67 LI、PCNA LI及AgNORs计数等之间均有明显的相关性。 如果您的实验室暂时尚不具备现代实验条件．只要有显微镜，只要您能准确识别核分裂像，只要能避免那些影响重复性的因素，在创新思想的设计下，即便使用最简单的方法，也可取得有意义的结果。 （二） 测定细胞增生活性的应用与价值 判断肿瘤的良恶性 肿瘤的病理学分级 判断肿瘤患者预后 测定细胞增生活性除在肿瘤学领域广泛应用外，在有的非肿瘤性疾病如肾小球肾炎增生细胞的研究已有广泛应用，在其它疾病如类风湿性疾病，宫内膜异位症等已有报道，在凡涉及反应性增生的疾病中，也有广泛应用的前景。 细胞凋亡（apoptosis），或称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）或细胞自杀（cell suicide），是细胞自身的一种主动的、生理性死亡机制，是一个多步骤发生的、受基因调控的遗传机制。 二、细胞凋亡检测技术 细胞坏死与细胞凋亡示意图 1.正常细胞 2.凋亡细胞皱缩 3.凋亡细胞分叶 凋亡小体形成 4.巨噬细胞吞噬凋亡小体 5.细胞肿胀 6.细胞崩解、自溶 （一）凋亡过程中细胞的形态学变化 （二）细胞凋亡的形态学检测方法 大部分情况下发生的凋亡都具有典型的形态学特征，因此可通过各种方法制片及染色后，用光镜、荧光显微镜，或电子显微镜进行观察，其识别比较容易。 1.凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测 （1）制片 ①常规组织学切片，进行脱蜡和水化。 ②培养细胞可用细胞离心仪制片。注意：由于凋亡细胞在制片中容易破碎，所以应采用低速离心制片（250g，离心5min），并事先将载玻片做防脱片处理，使细胞易于贴附。离心后的片子稍经空气干燥后，迅速于1％多聚甲醛4oC下固定15—30min，然后转入80％乙醇后固定1—2h，保存于-20oC待用。 * * 细胞增殖与凋亡的原位检测技术 一、细胞增殖活性原位检测技术 细胞增殖(cell proliferation) 是细胞数量的增加，其快慢即为增殖活性。 ①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。 ②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期， ③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。 细胞周期图 G0期细胞：细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期 依据细胞的分裂能力，机体的细胞分为三类： 不稳定细胞(labile cells) ， 持续分裂细胞 稳定细胞(stable cells) ， 静止细胞 处G0期 永久细胞(permanent cells) ，不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞 根据细胞周期将细胞群分为两类 分裂细胞指进入G1期后进行分裂的细胞； 非分裂细胞是指处于G0期细胞及非增生的终末细胞。 肿瘤细胞群也如此。 增殖分数或生长分数 分裂细胞与细胞总数之比值。 生