普通微生物外源基因在细菌中的表达.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * 3、外源基因的分泌产物 包涵体 √难溶、非正确折叠、无生物活性； √可获得大量的外源蛋白。 一、基因工程药物 胰岛素 全球糖尿病发病人数共3.82亿，中国占到全球的四分之一，共9800万。 胰岛素参与调节碳水化合物和脂肪代谢，控制血糖平衡，因此胰岛素可用于治疗糖尿病。 重组人胰岛素 方法一：AB链合成——已被淘汰 以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融合基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。 通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。 方法二：逆转录法 重组人胰岛素 方法一：AB链合成 重组人胰岛素 方法二：逆转录法 乙肝疫苗 接种人群广泛 乙肝病毒表面抗原基因 酵母细胞 蛋白纯化 乙型肝炎疫苗 疫苗？ 二、基因工程在农业上的应用 转基因大豆 2006年，转基因大豆依然是最主要的转基因作物，占全球转基因作物总种植面积的57%。 转基因大豆主要有两种，即抗除草剂转基因大豆和抗虫转基因大豆。 美国的转基因大豆出油率高、价格比中国东北大豆更便宜，中国中粮集团等公司都大量进口美国大豆。 二、基因工程在农业上的应用 大豆产品 你对转基因食品什么态度？ 二、基因工程在农业上的应用 转基因动物 转基因猪用途及展望 2、增加抗病性 通过转基因来增强猪对疾病的抵抗力也是一项很有前途的研究领域，但是，这方面的研究仍较少。 1、提高生产性能 获得的转基因猪生长速度提高11.8%～14.2%，也留下了一些后遗症，死胎和畸形率较高，患关节病、胃溃疡、肾病和生殖能力丧失症的较为普遍。 3、作为人类疾病的研究模型 建立了包括皮肤、消化器管和心血管系统等相关疾病的转基因猪模型。 . 。 转基因猪用途及展望 4、用作生物反应器 人们可以将编码罕见的，具有医用价值的人体蛋白基因转移给猪，使其在猪体的血液或乳腺等组织中表达，从而可以在乳汁或血液中获取转基因表达产物。 5、异种器官移植  三、基因治疗 指向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 1.用正常的基因弥补有缺陷的基因—遗传病； 2.通过移植基因刺激免疫力—肿瘤和艾滋病； 3.基因转移配合细胞或药物治疗—增强特异性或疗效。 1990年美国腺苷脱氨酶(ADA)基因导入患者外周淋巴细胞治疗重度免疫缺陷综合征(SCID)。 基因治疗的安全性问题 四、基因工程研究展望——机会与挑战并存 制药 农业 医学 食品 . . . 安全性 伦理 * * * * * * * * * * * * 张莹 实验楼A 413 大肠杆菌 毕赤酵母 番茄叶子 Hela细胞 大肠杆菌中表达外源基因 1. 同源克隆获得对虾整合素的cDNA全长序列 大肠杆菌中表达外源基因 2. 整合素多序列比对和空间结构分析 大肠杆菌中表达外源基因 3. 整合素的βA结构域的重组与蛋白纯化 M 1 2 M 3 4 5 6 Trx βA M:蛋白marker 1：pET32-integrin重组蛋白诱导前 2：pET32-integrin重组蛋白诱导后 3：纯化的pET32-integrin重组蛋白 4：pET32诱导前 5：pET32诱导后 6；纯化的Trx蛋白 大肠杆菌中表达外源基因 4. 整合素在大肠杆菌中大量培养及纯化 大肠杆菌中表达外源基因 5. 整合素重组蛋白的活性鉴定 表达载体 表达载体：具有宿主细胞基因表达所需调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 克隆载体与表达载体的区别 克隆载体：高拷贝、导入原核细菌、大量复制。 表达载体：高拷贝或低拷贝、导入工程菌或细胞（导入的基因由克隆载体产生、高蛋白表达效率。 克隆载体 是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体 一、外源基因的转录 1、启动子 位于转录起点上游，为RNA聚合酶结合并起始转录的一段DNA控制序列。 -35区： RNA聚合酶识别并结合的位点 -10区： RNA聚合酶于该处解开DNA双链，并决定转录起点 启动子的种类 （1）Lac启动子: 乳糖操纵子 启动子 Lac启动子受CAP（分解物激活蛋白）和cAMP的正调控 启动子的种类 （1）Lac启动子: (IPTG) Lac启动子受阻遏蛋白的负调控，lacUV5失去了CAP和cAMP的正调控， 只要有乳糖或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)时就可启动转录。 启动子的种类 （2）Trp启动子: Trp启动子的阻遏蛋白必须与色