冰冻切片免疫组化注意事项.pdfVIP

持了原有的组织形态。在免疫组织化学染色中，能较好地保存细胞抗原的免疫性，同时冰冻切片免疫组化 染色也简化了操作，提高了实验的可靠性…。现结合我们所做的实验问题总结如下。 一、冰冻切片 1．冷冻温度及切片厚度 温度过低组织块过冷、过硬，切片易碎；温度过高组织块冷冻不够，不能成片。对不同组织切片温度 的要求不同，据其设置温度。制片时必须做到组织在极短时间内骤冷速冻，才能保证镜下观察组织结构清 晰，细胞形态完好，没有冰晶干扰。骤冷速冻是制作高质量冰冻切片的关键。液氮法速冻，使组织温度骤 降，可减少冰晶的形成。常规免疫组化染色、HE染色切片厚度一般为51am一7Inn。 另应注意： (1)如遇破碎或破溃组织，建议将切片机温度设置在．22℃～23℃，切片厚度调置为 作箱工作温度下制作冰冻切片效果是不理想的，容易使组织内形成冰晶，影响标本质量和镜下形态结构， 切片温度应调置在一26C～28℃，厚度依组织而异。(3)因取材、冻存过程中造成组织不新鲜、明显有冰 晶形成或被酒精浸过的，这样的组织切片后镜下结构不清晰宜放弃。· 2．固定 染色结果首先取决于组织固定效果，若固定不佳，或固定剂选择不当，不仅结构不清晰，特异性抗原 显示不良，而且整片背景染色深，影响结果的判断。因此选择最佳的固定方法和最适合的固定剂与免疫组 织染色的好坏有着十分密切的关系。固定液有多种，不同的固定液具有不同的作用，至今还没有一种固定 液能用于所有染色的组织固定【zJ。 二、免疫组化染色 染色前必须将切片中的固定液及胶水洗净，从低温冰箱中取出的冰冻切片冲洗前还要室温干燥。尽管 冰冻切片不需抗原修复，但有些实验室己常规作修复，使显色效果较好。另外，温度对本试验影响较大， 为使实验重复性较好，每次实验前使用空调控制室内温度。 1．抗体选择、保存、稀释、孵育 抗体选择。抗体是否符合实验要求，因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造 成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解 决。检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。抗体稀释应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀 释的抗体一定要当天使用。抗体与抗原的匹配使用的一抗必须和二抗匹配，这一点非常重要。比如一抗是 兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；一抗是小鼠的IgM抗体，二抗必须是山羊，兔抗小鼠的 lgM二抗。 抗体的保存。抗体是免疫组化最基本的试剂，因为抗体是蛋白质构成．保存或使用不当，不但会造成 浪费，而且试剂变质会出现假阴性结果。所有抗体应严格按照说明书要求存放使用。一般即用型试剂在4C 冰箱保存，尽量缩短滴加抗体时间，并在有效期内使用，对原装浓缩液的抗体，收到抗体后在12000rpm 离心1．5分钟后再打开管盖进行分装和保存(如果抗体体积小于50ul，延长离心时间至5分钟，以保证全 部抗体均离心下来。比较合适的保存方式是分装后保存在．20C或．80℃。对绝大多数抗体来说，保存在-20℃ 是完全足够了。没有任何证据显示保存在一80℃会有更多的好处。分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体 活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。分装的量以一次实验用完为 好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响复融 后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在412，避免再冻起来。抗体工作液应该当天配制当天用 完，在4C尽量不要超过l天。绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而 不是门上。 抗体稀释及孵育。一般拿到新的抗体后会先用阳性组织做一个剃度，看看最佳反应的稀释比例，选择阳 158 性结果明显且背景低的浓度。然后选择一个比较好的比例，再检测标本。一抗、二抗应严格按照说明书要 求稀释，一般可用pH为7．4的PBS直接稀释，但实践证明5％小牛血清或5％牛血清白蛋白稀释效果更好。 5％牛血清白蛋白冷冻室中搅拌过夜，pH调至7．4，离心后取上清液，分装，．20℃储存。一抗孵育最好在 4。C冰箱过夜(约18h)，二抗及复合物孵育时间不要太长，否则容易过染，按照说明书要求即可。时间和 温度孵育时间和温度对提高抗原抗体的结合率，增强免疫反应有重要意义。孵育时间过短，抗原抗体结合 不够充分，染色较浅。延长孵育时间后特异性免疫反应明显增强，染色明显加深，阳性反应率也明显提高。 2．非特异性着色处理 内源性生物素消除。对于SP法这种基于亲和素一生物素系统的方法，必须常规内源性生物素消除步 骤，否