干扰素-α%2fβ抗MGMT阳性胶质瘤干细胞化疗耐药的体外研究.pdfVIP

化疗作为恶性胶质瘤规范化综合治疗的手段之一，在初治和复发恶性胶质瘤方面的应川越米越受到重视。替 莫唑胺作为一个里程牌的化疗药物，将脑肿瘤的化疗推进了一大步。然而，即便如此，恶性胶质瘤对丁．常规放疗 及化疗也高度抵抗，即便术后行替莫唑胺同期放化疗，胶质母细胞瘤患者的中位生存期也仅由12．1个月提高剑 质瘤化疗耐药及肿瘤复发进展的重要原冈。如何克服MGMT及干细胞造成的耐约，找寻有效针对耐约靶点的约物， 提高替莫唑胺的化疗敏感性，将直接影响患者的临床疗效及生存期。 我们注意剑了干扰素一a／B在恶性胶质瘤治疗中的重要作．Hj，拟以MGMT表达阿IJI生的胶质瘤干细胞为模型， 探讨干扰素一Q／B对丁．提高替荚唑胺化疗敏感性的作用及机制。 1材料与方法 1．1材料 提取试剂盒和细胞基冈组DNA提取试剂盒均购于北京Tiangem K B引物(208bp)：正义链： 5’一CGCTCTCTGCTCCTCCTGlvrC一3’，反义链：5’一ATCCGTTGAcTCCGACClvrCAC一3’。小鼠抗人GFAP、Nestin、TUffl BiotecGmbH。无胸腺小鼠 和兔抗人Sox-2抗体购白美国Chemicon。小鼠抗人CDl33抗体购买于美国Miltenyi nudemice (athymic free 动物有限公司提供(SCXK，批准号：沪2002—0003)，按SPF(specificpathogenanimals)的标准饲养。 小鼠抗人MGMT单克隆抗体购买丁．美国Invitrogen。小鼠抗人NF—K 同t：化学研究所。 1．2方法 1．2．1胶质瘤干细胞的诱导 洗涤3次以去除血清。加入干细胞培养基后于培养箱中培养，24—48h后于显微镜．卜．观察胶质瘤干细胞球形成状况。 胶质瘤干细胞培养3-4周后即可用于后续试验。 246 1．2．2胶质瘤干细胞的鉴定 取培养后的胶质瘤干细胞进行干细胞分子标记鉴定和裸鼠移植成瘤试验。①干细胞分子标记鉴定：取培养后 的胶质瘤干细胞克隆培养丁．经多聚屿氨酸处理的盖玻片上，贴肇过夜后收集样本进行免疫荧光染色(方法参j!《c试 质瘤干细胞球以及有血清培养的贴鼙细胞。调整细胞密度至1X105个／mL，均分别l×104个注射胶质瘤干细胞与胶 质瘤细胞丁4周人的BALB／C裸小鼠背侧皮卜(注射液体积为100u L)，2天观察一次，观察肿瘤出现的时间和人小， 刖游标膏尺耸度肿瘤最人直径。 1．2．3Western Blot检测胶质瘤细胞及干细胞中MGlff蛋白表达 分别从细胞培养瓶中收集胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞，提取细胞总蛋白。调蛋向样品至等量，采用10％ 分析。 1．2．4 ccK-8法检测干扰素一Q／13对TMZ的化疗增敏作用 pL。 分别将两种胶质瘤干细胞制备成单细胞悬液接种于96孔板中，接种密度为5000个／孔。悬液体积为190 u (500umol／L)；96h后每孔加CCK一8溶液20L，孵育4h，终JJ=培养。在MultiskanMK3酶联免疫监测仪上选择490hm 波艮测定各孔光吸收值，分析各组药物对GSC增殖的影响。 1．2．5 RT-PCR检测干扰素一a／B作用后对GSC中MGMT、NF-KB mRNA表达水平的影响 FirstStrandcDNA 别提取各组细胞总RNA。应刚逆转录试剂盒RevertAid Synthesis