第四章 外植体的选择、消毒和接种.pptVIP

第四章 外植体的选择、消毒和接种 (1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面； (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 污染的原因及其预防措施 1、污染：植物组织培养过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养失败的现象 2、污染的原因 一是病原菌污染（细菌、真菌） 二是外植体、培养基、培养器皿带菌 三是操作人员未遵守操作规程。 污染的预防措施 组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。预防措施有： 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌等措施； 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌等； 操作人员要按照操作程序进行。 在培养基中加入抗菌素 分散接种 六、外植体的褐变及其防止措施 褐变 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象 影响褐变的因素 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植物易发生褐变 。 基因型： 外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 培养基的成分：培养基中6－BA或KT能促进褐变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 材料转移时间： 褐变的防止措施 选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养物褐变 连续转移 加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸； 加活性碳 加多胺类物质，如精胺、亚精胺 培养物的玻璃化现象及其预防措施 玻璃化现象及其产生原因 培养物增殖培养时，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，培养基中离子种类，比例不适，琼脂浓度低，不良培养环境如温度过低或过高，光照时间过长及通气不良，易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻璃化现象 玻璃化现象的预防措施 适当控制培养基中无机盐浓度 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制好温度 改善培养皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质 培养阶段易出现的其他问题 氧气是组织培养中必需的因素。 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。 六、气体 真菌污染 假设污染率为95%： ? 100块材料，接种于100支试管，即1块/支。 得率为：P=（1-95%）?100=5块无菌材料 ? 200块材料，接种于100支试管，即2块/支。 P1（2污）=95% ?95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 ? 95%?5%=9.5% P3（2得）=5% ? 5%=0.25% 若得到1支试管的无菌材料，至少要接种： 1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌材料。 ? 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万块材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。 * * * 目的要求 掌握选择外植体的方法； 熟练掌握接种方法。 第一节 外植体的选择 外植体的来源是决定植物组织培养成败的一个重要因素。根据植物细胞全能性的的理论，任何细胞、组织和器官都可以作为外植体，但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大区别。 第一，选择优良的种质； 无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择