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第三章蛋白质工程概述 蛋白质工程 蛋白质工程的目的是以蛋白质的结构-功能研究为基础，运用基因工程技术定向改造天然蛋白质，或设计创造全新蛋白质； 蛋白质工程常被称为第二代基因工程； 1982年：通过定点突变获得改性酪氨酸tRNA合成酶； 1983年：Science发表以“Protein engineering”为题的专论。 基因工程与蛋白质工程的区别： 基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。 蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。 蛋白质工程药物发展三个阶段： 第一阶段：未经修饰的天然蛋白质被开发的药物（胰岛素、促红细胞生成素、干扰素） 第二阶段：在第一代基础上加以简单工程技术修饰（促红细胞生成素、干扰素） 第三阶段：优化药物的生物学活性和理化性质（一级结构的处理、化学修饰、蛋白质翻译后的修饰及融合蛋白的应用） 蛋白质工程的重要意义 为蛋白质结构-功能关系研究提供强有力的而且是不可替代的手段。 研制活性高、稳定性好和毒副作用小的新型蛋白类药物，以及新型的抗生素、定向免疫毒素和工程抗体。 构建具有独特的催化和分子识别功能的酶制剂和生物传感器。 改变或改良农作物的品质，设计生产新型生物杀虫剂。 二、蛋白质工程的研究内容 蛋白质工程4大类研究： 1、利用已知的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。 2、定量确定蛋白质结构-功能关系。包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化性质、蛋白质折叠和稳定性研究、蛋白质变异的探讨等。 3、从混杂变异体库中筛选出具有特定结构-功能关系的蛋白质。 4、根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体，完全人为控制蛋白质的性质。 蛋白质工程技术在新药研究中应用： 提高药效活性（TNF杀伤肿瘤细胞） 提高靶向性（作用于特定组织或细胞） 降低蛋白质类药物引起的免疫反应（人源化重组蛋白） 获得具有新功能的蛋白质分子（不同功能的部分重组） 其他（提高药物稳定性、改善药代动力学特性、使之易于生产纯化，减低成本） 三、蛋白质工程的基本步骤 分离提纯目标蛋白 对目的蛋白进行氨基酸测序 借助核磁共振、生物质谱获得蛋白质的二级和三级结构 设计编码蛋白质的基因改造方案 对基因序列进行改造，并将经过改造的基因片段采用基因重组技术获取该目的基因，表达新蛋白产物 分离提纯新蛋白并对功能监测后投入应用 蛋白质改造常用方法 理性方法 非理性方法 （一）定点突变改进蛋白质 基因人工定点突变是通过取代、插入或缺失基因DNA序列中任一特定的核苷酸序列来改造蛋白质的方法。 前提：已知蛋白质分子的结构和功能 分为三类：核苷酸引物诱变 盒式诱变 PCR诱变 核苷酸引物诱变 以化学合成的含有突变核苷酸的核苷酸短片段为引物，对单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子链的一个组成部分，新链便具有已发生突变的核苷酸序列。 盒式诱变 1985年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。 利用目的基因序列中的适当限制性内切性酶酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。 PCR诱变 双链DNA变性 94 oC，1 min 退火，引物结合 54 oC，45 s 链延伸 72 oC，2 min （二）采用融合蛋白技术改进蛋白质 概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起所形成的蛋白质，其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。 原则：将一个蛋白质基因序列的终止密码子删除，在接上带有密码子的第二个蛋白质基因，可实现2个基因的融合表达。 融合蛋白技术的内容 （1）进行目的基因的克隆，根据基因测序列互补原则，设计合理的引物序列，以cDNA为模版，利用PCR技术扩增不同的目的基因的DNA片段； （2）在载体中进行重组，通过限制性内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，通过连接酶将两个具有相同末端酶切点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 (3)将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选和测序。 （4）融合基因的诱导表达及蛋白质的纯化。 融合蛋白的应用： 靶向药物：（药物和可以与病灶特异结合的配基）将这两者融合，构成融合蛋白，它可以特异性地与靶细胞