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外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响 　　作者：徐爱华 柳忠兰 作者单位：中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 沈阳 110001 　　【摘要】 目的 研究外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法 将40只大鼠随机平均分为正常对照组、长期大量吸烟组(燃烧香烟10支×2次/d，共90 d)、短期大量吸烟组(燃烧香烟10支×2次/d，共45 d)、吸烟+bFGF组(燃烧香烟10支×2次/d，共90 d,吸烟最后15 d经腹腔内注射bFGF 200 Μg/ml)，每组10只。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL法)及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果 各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P0.01)，凋亡细胞数量和p53蛋白表达强度随吸烟时间和剂量增加而增加。bFGF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P0.01)。结论 吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加，细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关，bFGF 通过抑制p53表达减少细胞凋亡。 　　【关键词】 外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);吸烟;凋亡;p53 　　基金项目：卫生部科学研究基金资助项目(981196)，辽宁省自然科学基金资助项目(9810500303) 　　近年研究发现，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种神经营养因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用。目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡影响的报道。本研究将外源性bFGF应用于吸烟大鼠，通过对大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达进行分析，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡的作用及其机制，进一步为临床应用bFGF提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 健康成年雄性Wistar大鼠40只(由中国医科大学实验动物中心提供)，体重200～250 g，随机分为正常对照组、长期大量吸烟组、短期大量吸烟组、长期大量吸烟+bFGF组，每组10只。饲养室内温度、湿度保持恒定，自然光照，自然通风，大鼠可自由接触食水。 　　1.2 方法 　　1.2.1 试剂 bFGF购自北京白鹭源生物技术责任有限公司。p53抗体、SABC免疫组化试剂盒、凋亡试剂盒均购自武汉博士的生物制品实验有限公司。尼古丁来自含量为1.5 mg/支的市售某品牌香烟。 　　1.2.2 模型制备 将各吸烟组大鼠置于80 cm×60 cm×40 cm的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。长期大量吸烟组燃烧香烟10支×2次/d，共90 d;短期大量吸烟组燃烧香烟10支×2次/d，共45 d;长期大量吸烟+bFGF组燃烧香烟10支×2次/d，共45 d，并于吸烟最后15 d腹腔内注射bFGF 200 Μg/ml,按135 Μg·kg-1·w-1经腹腔内注射给药，每日2次，连续15 d。 　　1.2.3 检测指标 细胞凋亡:切片依次经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K 20 Μg/ml 37℃消化15 min，TBS(pH 7.4)洗5 min，3次。滴加TUNEL反应液(TdT 1 Μl，DIGdUTP 1 Μl，18 Μl标记缓冲液，20 Μl/片)，37℃孵育2 h。TBS洗2 min，3次，加生物素化地高辛抗体，37℃孵育30 min，TBS洗2 min，3次，DAB显色，苏木素复染。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉TdT酶，其余操作同上。免疫组化染色:切片常规脱蜡入水,0.3%过氧化氢37℃作用10 min灭活内源性酶。0.01 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压修复2 min左右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37℃，20 min。加p53抗体，4℃过夜。PBS洗5 min，3次，加生物素化羊抗兔IgG 37℃孵育20 min，PBS洗2 min，3次。滴加SABC 37℃，20 min。PBS洗3 min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。 　　1.3 统计学处理 用显微成像系统采集图片，计算并分析阳性细胞平均灰度值，数据用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，各组间比较用两样本均数比较的t检验。 　　2 结果 　　2.1 大鼠脑细胞凋亡 凋亡细胞TUNEL阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小体,正常对照组偶有散在的凋亡细胞。各吸烟组与正常对照组相比凋亡细胞明显增多(P0.01)。长期大量