中国药科大学生化设计性实验报告参考——RNA快速提取一步法的建立.pdf

北 京 医 科 大 学 学 报 J OU RNAL OF B EIJ IN G M ED ICAL UN IV ERSI T Y 　Vol . 3 1 　No . 5 　Oct . 1999 ·46 1 · RNA 快速提取一步法的建立 △ 梁德勇 　徐国恒 　崔振中　王晓民　朱丽霞 　韩济生 (北京医科大学神经科学研究所 ,北京 　100083 　△中国中医研究院针灸研究所) 　　RNA 是分子生物学研究的一个重要组成部分 , 不论是 14 . 3 　快速 RNA 提取试剂的配制 　用 CSB 缓冲液配制 4 ( - 1 - 1 ( cDNA 文库的构建 、R TPCR 、RNA 序列分析 、差异显示 mR mol ·L 异硫氰酸胍 ;加入 0 . 1 体积 4 mol ·L 乙酸钠 p H NA differential display ) 、代表 性差异分析 ( representational 4 . 0) , 加入等体积酸酚 , 0 . 02 体积 的异戊醇 , 混匀 , 即为 ) ( RNA 快速提取试剂 。4 ℃保存备用 。 Difference Analysis , RDA 、抑制性消减杂交 suppression Sub traction Hybridization , SSH) 、Nort hern 印迹分析 、蛋白质的体 15 　RNA 快速提取程序 外翻译等均依赖于高纯度完整的 RNA 。因此 , 如何获得高 组织 RNA 的提取 : 将约 10 ～100 mg 的组织块置于匀 质量的 RNA 是研究人员关注的问题 。1987 年 Chomczynski 浆仪中 ,加入 1 ml RNA 快速提取试剂 ,进行匀浆 ;将匀浆液 [ 1 ] ( 倾入 1. 5 ml 离心管中 ,加入 0 . 1 体积的氯仿 ,振荡混合 20 s ; 等 建立了酸异硫氰酸胍苯酚氯仿一步法 acidguanidine p henolchloroform , A GPC) 。该方法较 以往的传统方法操作 冰上放置 5 min ;4 ℃离心 12 000 r ·min - 1 , 15 min 。离心管中 简单 ,无需特殊的设备 ,抽提时间缩短至 4 h , 因而得到广泛 的液体分为 3 层 : 上层为无色透明的无机相 ,RNA 保留于此 的应用 。数家公司据此开发出 RNA 提取试剂盒[2 ,3 ] 。使用 相中;下层为呈淡黄色的有机相 ,蛋白质保留于此相中;上下 试剂盒简单方便 ,但价格相对昂贵 。为探索操作简便 、经济 两层的界面处为中间层 ,DNA 保留于此相中。小心吸取上 实用 、快速有效的 RNA 提取方法 ,我们分析了大量相关文献 层水相约 0 . 5 ml 于新管中 ,切勿吸取中间层和下层液体 , 以 资料 ,进行了多次实验 ,成功地研制出一种新型的 RNA 提取 避免 DNA 和蛋 白质 的污染 。异丙醇沉淀 : 加入等体积 的 试剂 ,建立了其操作程序 ,我们称之为 RNA 快速提取一步 - 20 ℃预冷 的异丙醇 , 混匀 , 4 ℃离心 12 000 r ·min - 1 , 15