更年安怡片对围绝经期综合征信号转导相关基因表达谱影响的的研究.pdfVIP

湖能中医学院2005届硕士毕业论文 中文摘要 目的: 围绝经期是妇女由生育期向老年阶段过渡的时期，此期卵巢机能逐渐衰退，卵 巢萎缩，雌激素含盘明显下降，导致下丘脑一垂体一性腺轴的改变。一部分妇女 在此期间不能适应这种变化，而出现以阵发性潮热汗出等为主要症状的一组综合 症候群，即围绝经期综合征。随着社会、生活、环境因素的改变，传染性疾病得 到控制，围绝经期综合征的发病率有增加趋势，使得人们日渐重视该病对中老年 生活质t的影响。近年来，国内外对围绝经期综合征机理的研究集中在生殖内分 泌和神经内分泌方面，虽然从一定程度上说明了该病的发病机制，但围绝经期综 合征的发病原因还是不甚明了，因此有必要从其他方面研究该病的发病机制。 从目前国内外治疗围绝经期综合征的方法来看，西医多采用激素替代疗法 (1RT)，虽有一定疗效，但易引起较大的副作用和较高的复发率，并存在致癌的 潜在危险。众多临床报道已证实，中医药治疗围绝经期综合征有良好疗效，且副 作用小，长期服用安全可靠，临床应用前景广阔。我们对补肾健脾为主的中药复 方制剂更年安怡片的前期临床与实验表明:更年安怡片具有良好的临床疗效，有 效率达96 ;同时能调节植物神经功能，调节生殖内分泌，提高免疫能力，防治 骨质疏松，防治心血管疾病，延缓衰老，安全无毒. 本课题拟通过更年安怡片对围绝经期综合征患者治疗前后的基因变化，从细胞 信号转导相关荃因转录水平的改变进行初步探讨，试图利用基因芯片这种高通量 信息分析新技术，筛选出有意义的细胞信号转导有关的荃因，为更年安怡片治疗 围绝经期综合征的机制从分子水平方面作出初步探索。 方法: 本实验以围绝经期综合征肾虚脾弱型患者为对象，用更年安怡片治疗4周。于 治疗前、后各采外周静脉血 5ml，肝素抗凝。取血后马上分离白细胞，加入 lml Trizol试剂，混匀，打散，直到形成清亮不粘稠的液体，40C保存.然后用Trizol 一步法提取细胞中的总RNA，通过异丙醉沉淀法浓缩RNA，并进一步对总RNA进行 过柱纯化，最后用分光光度计定盆，甲醛变性胶电泳质检.杂交与清洗:标记的 RNA溶于杂交液中，于420杂交过夜。杂交结束后，先在42.左右的液体中清洗， 而后在0.2xSSC中室温清洗。玻片甩干后即用双通道激光扫描仪进行扫描。实验 共用两张芯片，一张芯片用Cy5标记治疗前，Cy3标记治疗后;另一张芯片用Cy3 标记治疗前，Cy5标记治疗后，以消除吸光度造成的差异.将所有数据的前景值 与背景值相减，得出Cy5,Cy3的荧光信号值.芯片图像的采集与数据分析:分 析芯片图像，把图像信号转化为数字信号;然后对芯片上的数据用Lowess方法进 行归一化;最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。 结果: 1,RNA抽提结果:吸光度OD260/280值1.9.29S和18S清晰可见，5s隐约 可见，3条带均无明显降解，说明所提取的总RNA完整性好.2、样品芯片杂交 伪色图，Cy5用红色表示，Cy3用绿色表示.3、样品芯片杂交散点图，是两张芯 片整合后的图，可以比较直观地看出在两个样品之间荃因表达的差异情况。红色 标记和绿色标记的数据点分别表示Y/Xratio值)2和(0.5，可能是属于表达有差 异的基因，黑色标记表示Y/X的ratio值在2和0.5之间，表达基本无差异.4, 治疗前、后的白细胞提取物作基因芯片杂交后，检测出Y/Xratio值}2和0.5. 湖北中医学院2005届硕士毕业论文 很可能是表达有差异的基因，共48条。这些基因很可能是与围绝经期综合征用更 年安怡片治疗影响密切相关的基因.它可分为二类:一类是治疗后明显下调(ratio 值-0.5)的基因共36条;一类是治疗后明显上调((ratio值)2)的基因共12条.本 研究中经更年安怡片治疗后，897条信号转导相关基因表达明显改变的基因共有 48条，差异表达超过5%，扣除误差，差异表达仍超过4%，再排除个体差异，差 异表达基因数目仍旧较多. 结论: 实验结果表明:与治疗前相比，治疗后大部分墓因表达呈下调趋势，下调基因 占75%。下调基因可简单理解为，这些基因表达过高，通过药物治疗后分别下调， 可以理解为抑制其过高的表达，有可能提示为更年安怡片治疗围绝经期综合征的 作用机理之一。而上调的12条墓因可以理解为治疗后其过低的基因表达增强，也 有可能提示为作用机理之一 本研究体现了中医药治病的多方面、多