亲本细胞制备.doc

亲本细胞的准备 细胞融合技术中亲本细胞的准备通常包括：小鼠骨髓瘤细胞的准备以及脾细胞的准备。 1）收集骨髓瘤细胞 一些品系的小鼠经腹腔注射矿物油可诱生出骨髓瘤。骨髓瘤细胞由于存在合成和分泌蛋白的机制，也会分泌一些免疫球蛋白。一般用于融合的骨髓瘤细胞通常都是经筛选出来的缺失抗体分泌能力的细胞株，已避免杂交瘤细胞分泌一种以上的免疫球蛋白而影响单克隆抗体的产生。 对于骨髓瘤细胞的冻存，通常应用如下步骤： （1）在融合前一周左右复苏冻存的小鼠骨髓瘤细胞， （2）将保存细胞从液氮中取出后立即置于37～39℃温水浴中， （3）融化后取出细胞，充分洗涤除去冷冻液， （4）悬浮于含20%胎牛血清的DMEM或RPMI-1640完全培养基中，对细胞计数并检查活力（≥90%），调整细胞浓度， （5）细胞培养液中可添加8-AZ防止HGPRT酶缺失回复突变， （6）经24h培养稳定生长后，细胞即进入对数生长期，此时应及时更换新鲜培养液保持细胞充分营养供应，并调整细胞浓度，使细胞保持在对数生长期。 作为亲本的骨髓瘤细胞虽然具有无限的繁殖能力，然而长期体外培养可能会对以后的融合产生不利影响。因此，对产生较高融合率的亲本骨髓瘤细胞应培养扩增一批，并及时冻存以用于下一次融合，细胞的冻存可用精密的细胞冷冻仪，也可用简单的方法冻存而获得良好效果。 在获得脾细胞后，为增加具有抗体活性细胞的融合前先富集对抗原具有特异性的B细胞，然后再进行细胞的融合。或者将抗原直接交联到骨髓瘤细胞表面，在与脾细胞共温育，往往可以得到更多的融合体。 2）收集小鼠脾细胞 脾细胞分离，一般在末次免疫后3-5d左右即可取脾脏分离淋巴细胞。收集脾细胞过程中要严格进行无菌操作，是整个过程都处于无菌状态。 从小鼠体内得到脾细胞有以下方法; 不锈钢网挤压法： (1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表； (2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次； (3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟； (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。 针对于这种方法对脾细胞损伤较大，因此，现在很少使用。而被另外一种方法所取代。 通过断颈处死，皮肤消毒等步骤取出脾脏，注入0.5ml无血清培养基使脾脏轻度肿胀，用小号针头多点刺破脾脏被膜，轻轻挤压使淋巴细胞逸出。（这种方法对脾细胞的影响较小。） 利用以上两种方法所得到的细胞悬液中都存在红细胞，可能会对融合造成不利影响，因此很多研究人员采用尽量放血来处死动物，以减少脾内红细胞的数量。