油镜的使用.docVIP

实验一 油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察 细菌个体微小，必须借助显微镜来观察其形态结构。但是活细菌为无色半透明状态，在普通光学显微镜下不易观察清楚，常用染色的方法使细菌着色，使之与背景形成鲜明对比，再在显微镜下观察，可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。 目的和要求： 1、熟悉显微镜油镜的使用方法。 2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构 3、学习革兰染色法 油镜的使用 实验材料： 标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。 实验原理： 使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。 实验方法及注意事项： 1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。 2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。 3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。 4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。 5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。 6、显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形，集光器下降，反光镜推平，光圈关上，归还显微镜室。 革兰染色法 革兰染色法(Gram stain )：革兰染色法是丹麦细菌学家革兰(Christain Gram)于1884年发明的。至今已逾百年,但仍在广泛使用,是细菌学中最为经典的染色法。 原理 革兰染色法的原理目前尚不完全清楚，主要有三种学说； ①等电点学说：革兰阳性菌等电点（pH2～3）比革兰阴性菌（pH4～5）低，一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右,电离后阳性菌所带负电荷比阴性菌多,因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易脱色。 ②通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构比较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易透入,反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障,阻止染料向细胞外渗。革兰阴性菌细胞壁疏松,肽聚糖层很薄,而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质,易被乙醇溶解,致使细胞壁通透性增加,细胞内的结晶紫一碘复合物容易被乙醇溶解而脱出。 ③化学学说：革兰阳性菌细胞内含有某些特殊化学成分,一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物,它和染料与媒染剂复合物相互结合,使已着色的细菌不易脱色。 革兰染色的意义：将细菌染成两大类，即革兰阳性菌和革兰阴性菌,可用于鉴别细菌；研究细菌的致病性，革兰阳性菌可产生外毒素，革兰阴性菌可产生内毒素；选择敏感的抗生素，革兰阳性菌可使用青霉素等作用于细胞壁的抗生素，革兰阴性菌可使用红霉素、链霉素等抑制蛋白质合成的抗生素。 材料 1、菌种：葡萄球菌、大肠杆菌培养物。 2、染液：结晶紫染液、碘液、95%酒精和稀释复红。 3、其他：玻片、接种环、酒精灯等。 方法 1、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。 注意：拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 2、干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。 3、固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。 固定的目的是： ①杀死微生物，固定其细胞结构； ②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。 4、染色 ①初染:在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液2～3滴,染1min,用水冲洗。 ②媒染：滴加媒染剂碘液数滴,1min后用水冲洗。 ③脱色：滴加95%酒精脱色,轻轻摇动玻片几秒钟,使均匀脱色