魚類病毒性神經壞死症防疫手冊.ppt

魚類病毒性神經壞死症 (Viral Nervous Necrosis Disease, VNN) 防疫手冊 目錄 病毒性神經壞死症 (VNN) 的起源 病毒性神經壞死症的病徵 神經壞死症病毒 (NNV) 的特性 神經壞死症病毒的基因型 (genotype) 與血清型 (serotype) 神經壞死症病毒的地理分布與宿主範圍 溫度與病毒性神經壞死症爆發之關係 病毒性神經壞死症流行病學 (Epidemiology) 之研究 神經壞死症病毒引發之病程及在宿主體內之分布 神經壞死症病毒的持續性感染 神經壞死症病毒的檢疫方法 神經壞死症的防治方法 病毒性神經壞死症 (VNN) 的起源 病毒性神經壞死症 (Viral nervous necrosis disease, VNN disease)，最早發現於 1986 年日本長崎縣 (Nagasaki) 的日本鸚鵡魚 (Japanese parrotfish)繁殖場。 魚苗體長 6-25 mm，六、七月水溫升高時發生大量死亡。 發病魚苗失去平衡，病魚的腦及視網膜有壞死現象。 以電子顯微鏡觀察病變組織，發現大量不具外套膜、型態介於圓形與二十面體之間，直徑約 34 nm 之病毒顆粒，被認為是造成此疾病的病原體，稱之為神經壞死症病毒 (Nervous necrosis virus, NNV) (Yoshikoshi and Inoue, 1990)。 病毒性神經壞死症的病徵 (石斑魚) 疫情主要發生在八分苗或更小的苗，死亡率接近 100%。 最早發病時間可在孵化後第 17 天，吋苗死亡率仍有 70-80%，幼魚死亡率則較低 (圖 1)。 罹病魚苗在水面會有突發性的迴旋打轉，衝入水底再浮上水面。 魚苗體色變深，部份魚苗會發生脊椎側彎，有時會側浮於水面上 (圖 2)。 魚苗發病時會食慾不振，群聚在池邊。 此病為急性傳染病，開始看見病徵後，一週內會出現大量死亡。 一般光學顯微鏡下，檢查發病魚的病理組織切片，都會有腦部及視網膜嚴重的空泡化現象 (圖 3)。 以電子顯微鏡觀察病變的腦組織及視網膜，可在發生空泡化的細胞內看到大量病毒顆粒，散佈在細胞質內或留在膜系胞器中 (圖 4)。 神經壞死症病毒 (NNV) 的特性 NNV 病毒不具外套膜，型態介於圓形與二十面體間，直徑約為 20-25 nm (圖 5)。 有兩條不具 poly A tail 的單股正意核酸 (positive-stranded RNA)，其分子量分別為 1.01 × 106 Da (RNA1) 及 0.49 × 106 Da (RNA2) (圖 6A)。 RNA1 可轉譯出分子量為 100 kDa 的蛋白質，其功能為 RNA-dependent RNA polymerase。 RNA2 可轉譯成病毒的鞘蛋白質，由 42 kDa 及 40 kDa 所組成 (圖 6B)。 根據病毒型態、核酸特性，此病毒在分類上屬於結病毒科 (Nodaviridae)、魚類結病毒屬 (fish nodavirus；betanodavirus) (Mori et al., 1992；Nishizawa et al., 1995；Chi et al., 2001)。 Arimoto 等 (1996) 用下列化學物質處裡日本條紋鯵分離出來的 SJNNV 病毒株，可以使病毒失去活性： 1. 碘 (iodine) – 50 ppm 處理 10 分鐘。 2. 氯 (chlorine) – 50 ppm 處理 10 分鐘。 3. 紫外線 – 1.0 × 105 μw. sec / cm2。 4. 臭氧 (ozonation) 0.1 ppm 處理 2.5 分鐘。 5. 強鹼 (pH 12) 處理 10 分鐘。 6. 加熱 (60℃) 處理 30 分鐘。 由海鱸分離出的 NNV 病毒株能耐受 pH 2-9 之處理，亦可抵抗 56 ℃ 加熱 30 分鐘之處理 (Frerich et al., 1996)。 台灣養殖石斑魚分離出的 GNNV 病毒株在強酸 (pH 3) 與強鹼 (pH 10-12) 的環境下，病毒力價會下降約 104 TCID50 ，60 ℃加熱一小時，則能使病毒失去活性(Chi et al., 2001)。 神經壞死症病毒的基因型 (genotype) 與血清型 (serotype) 1994 年 Nishizawa 等人依據 SJNNV 的 RNA2 核酸序列設計出兩條順向引子 (forward primer) F1、F2，及三條逆向引子 (reverse primer) R1、R2、R3。 以萃取出的病毒核酸作為模版，以 RT-PCR 的方式經不同引子對的組合進行反應，可擴增出五種大小不同之目標片段 (T1,T2,T3,T4,T5)。 根據