在Klebsiella Pneumoniae醛脱氢酶失活菌中构建NADH再生系统.pdfVIP

中国生物工程杂志chinaBiotechnolog)r，2006，26(12)：75～80 在胁夙妇砌p忍秽比mD以施P醛脱氢酶失活茵中 构建NADH再生系统术 黄志华1’2 张延平1 黄 星1 王宝光1 曹竹安1掌+ (1清华大学化学工程系生物化工研究所北京1000842三明学院化学与生物工程系三明365004) 摘要 生产过程中，需要消耗还原当量NADH，NADH的有效供给决定了1，3-PD的产量和得率。采用 PCR的方法从仇砒6Di锄蔬基因组中克隆编码．触的基因，将该基因片段插入载体pMAL’M． p2x，构建表达载体pMALm—p2x—溉，并转入醛脱氢酶失活茵j池6s谢Z。p船聊mn施eDA一1HB，获得 重组茵胁6s记耽p船配啪乃池DAF-1。在IPTG浓度0．5m咖L／L时，诱导3h后甲酸脱氢酶表达明 显；发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到4．82U／mg；与出发茵株Kp聊u舢n池DA一1HB相比，重 组茵DAF-1合成1，3一丙二醇的浓度提高了19．2％。 关键词 醛脱氢酶 甲酸脱氢酶 NADH 慰ek如玩p础H，∞ni僦 1，3一丙二醇 中图分类号Q78 生物法生产1，3-丙二醇(1，3·PIDpanediol，1，3一PD)细胞代谢流并对NADH的消耗进行分配调控，提高了甘 是当前工业生物技术研究的热点之一¨·，而其中研究最 油到1，3一PD的转化率。从另一个角度看，提高NADH的 多的是利用蠡弛瓠fe池pn眦瑚ni伽以甘油为底物发酵生产 有效供给率的途径是增强胞内NADH再生效率。近年 l，3-PD。在野生型Kpe船啪on池中，1，3一丙二醇合成 来，甲酸／甲酸脱氢酶(FDH)辅酶再生系统引起了人们的 1，3．PD过程所需的NADH主要是在甘油氧化为丙酮酸 广泛关注，并成功应用于L叔-亮氨酸的工业生产M1。本 的过程中再生，这种NADH再生方式将甘油的还原代谢文以醛脱氢酶失活菌株为宿主，引入甲酸／甲酸脱氢酶体 途径与氧化代谢途径紧密联系在一起，调控难度大，且甘 系¨o，希望在“节流”的基础上，从“开源”的角度对K 油的消耗降低了1，3-PD的得率，因此生物法生产1，3一 p黼n池厌氧代谢进行辅因子调控，研究其对1，3一PD PD仍然存在着产物得率较低，生产成本较高等问题，制 合成的影响。 约了其工业化生产悼1。一般认为NADH的有效供给率 根据配幽谢如p础“啪n矗配代谢网络的特点，选取 决定了1，3一PD的产量和得率，本课题组在利用胁如纠如 NAD+一依赖型的甲酸脱氢酶(fo珊ate dehydrogenase， 眇删拧姗池厌氧代谢合成l，3-PD中发现，导致1，3一PD 得率下降的主要原因是大量副产物乙醇的生成H’41。醛 获取甲酸脱氢酶(foImate 脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作 ∽h)，将其插入到表达载体，而后将重组质粒转化到 用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为 醛脱氢酶失活菌Kp船u啪以口eDA-lHB中，成功构建 NAD+，降低了同为NADH依赖型的1，3-PD合成途径的 了肋基因表达重组菌足p舶u瑚n池DAF-1，通过发酵 效率。