重组腺病毒载体Ad-LMP-1构建及其转染MSC后成骨活性检测.pdfVIP

中山大学 重组腺病毒载体Ad．LMP．1的构建及其转染MSC后成骨活性检测 重组腺病毒载体Ad—LMP．1的构建及其转染MSC后 成骨活性检测 硕士研究生：刘冬斌 导师：沈慧勇教授 中文摘要 研究背景： 骨质疏松及其相关骨折严重影响老年人的生活质量，并由此带来巨大的经 济和社会健康负担；骨质疏松及其骨折的治疗多年以来一直是困绕骨科临床医 生的难题之一，随着我人口的老龄化，骨质疏松及其骨折患者也将逐渐增加， 因此寻找新的、疗效切实可靠且具有突破性进展的治疗方法具有重大的现实意 义。 骨质疏松基本病理机制为骨吸收和形成(骨重建偶联)的失衡，骨形成的 不足，或(和)骨吸收的增强导致骨量的减少，骨组织微结构的退变、骨脆性 增加和骨强度下降，骨折的易感性增加，骨折后的愈合能力显著降低。MSCs是 成体干细胞之一，具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞和等多种 细胞，骨质疏松个体的MSCs数量减少，质量也下降，增殖和成骨细胞分化能 力减弱，成骨能力也显著降低【l】oMSCs转染相关诱导因子基因后，不仅其增殖 能力没有受到影响，而且可以加强其定向分化的能力，比如转导入骨诱导基因 后，能有效促进骨的形成，修复骨缺损‘21，从而为骨质疏松及其骨折的基因治 疗提供了一个新的平台。 骨诱导因子是一类可促进局部或全身骨形成的的生物分子。LMP．1作为细 胞内信号分子，启动体内骨的形成的同时，刺激包括多种BMPs在内不同骨诱 导因子合成和分泌，促进临近的细胞分化并直接参加骨膜或软骨内成骨【3J，为 骨折的修复提供非常有利的环境，因此是理想的候选基因。MSCs的生物学特 性表明它该基因最佳的载体。与其它慢性疾病不同，OP骨折的治疗不必也不需 要让所转染的基因长达数周或数月持续的表达直至疾病痊愈，因而使转基因方 法更加切实可行。 中山大学 重组腺病毒载体Ad．LMP．1的构建及其转染MSC后成骨活性检测 ‘ 目的： 利用重组腺病毒载体Ad．LMP．1体外转染MSCs，通过对转染前后细胞成骨 活性的检测，明确LMP．1基因的成骨促进作用，为基因治疗骨质疏松做基础研 究 方法： 1．分离培养SD大鼠成骨细胞，提取提取总RNA，设计特异性引物并RT-PCR获 取LMP．1基因，电泳验证，切胶回收纯化。 序验证。 3．重组腺病毒载体在293A细胞中的包装。并初步确定感染复数MOI 4．分离培养大鼠MSC细胞，鉴定。 因在MSCs中的表达；通过检测碱性磷酸酶、胶原蛋白I、骨钙素以及，验证 LMP．1基因的成骨促进作用。 结果： LMP．1基因，通过电泳初步鉴定。 2．成功构建重组腺病毒载体AdLMP．1，通过酶切电泳以及测序验证完全正确。 3．通过两次转染293细胞，提取病毒DNA，PCR鉴定成功；成功确定重组腺病 毒载体感染复数。 4．成功分离培养SD大鼠MSC细胞，并通过成脂、成骨诱导鉴定以及表面标记 物鉴定。 5．重组腺病毒感染MSC细胞后，可检测LMP．1基因的表达，并且通过与对照 组的比较，验证了LMP．1基因的成骨促进作用。 结论： 利用构建包装成功的重组腺病毒载体Ad．LMP-1感染MSC细胞，可以检测到 LMP．1蛋白在细胞中的表达，并通过相关成骨活性检测，证明了LMP．1基因的 成骨促进作用，为后期的骨质疏松的基因治疗打下基础。 关键词：骨质疏松LIM矿化蛋白腺病毒载体基因治疗成骨活性 ll 中山大学 重组腺病毒载体Ad．LMP-1的构建及其转染MSC后成骨活性检测 Constructionofrecombinantadenovirusvector anddetectionof of Ad—LMP一1 activity ost