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shRNA阻断I型P13K信号传导通路对人胃癌SGc7901细胞的影响 中文摘要
细胞的影响
中文摘要
构质粒,观察其对靶基因P13KCAmRNA表达的抑制效果,并筛选出干扰效果最佳的
shRNA序列。
方法:选择针对人I型P13K信号传导通路基因P13KCAmRNA的特异性RNA
采用基因测序确保干扰序列已正确插入载体中;将质粒转染胃中分化腺癌SGC7901
细胞,通过shRNA结构阻断I型P13K信号传导通路,诱导细胞发生自噬性死亡。在
h、48h、72
转染第24 h镜下观察胃癌细胞形态学变化,转染48h后收集细胞总RNA,
mRNA
采用实时荧光定量PCR技术检测目的基因P13KCA、自噬相关基因MAP.LC3
h后收集细胞总蛋白,采用WesternBlot技术检测P13KCA蛋
的表达变化;在转染72
白催化亚基p110蛋白的表达变化;通过上述检测结果,筛选出效果最佳的shRNA干
扰序列。
结果:成功构建4种具有I型P13K信号传导通路靶向干扰的重组质粒,基因测
h
h后细胞出现明显皱缩,部分细
后镜下观察见细胞出现胞体皱缩、细胞间隙增宽,48
胞脱落,72h后见较多细胞脱落;48h后行荧光实时定量PCR技术检测各组P13KCA
以及MAP.LC3
mRNA均表达下调,其中干扰质粒样品No.705的P13KCAlmRNA表达量下调至空
mRNA表达量下调至空白对照组的O.4%
白对照组的2.4%±1.3%(p0.05),P13KCA2
mRNA均表达
±0.4%(p0.05),4组行shRNA干扰细胞的自噬相关基因MAP.LC3
上调,其中干扰质粒样品No.705MAP.LC3mRNA表达量上调至空白对照组的
h后Western
5198.39±0.04%(p0.05);72
蛋白表达情况,4组行shRNA干扰的细胞p110蛋白表达出现不同程度下调,其中干
I
shRNA阻断I型P13K信号传导通路对人胃癌SGC7901细胞的影响 中文摘要
扰质粒样品No.705
结论:成功构建的靶向shRNA质粒可有效阻断I型P13K信号传导通路,抑制
靶基因P13KCAmRNA以及相应蛋白的表达,上调自噬相关基因MAP.LC3mRNA的
mRNA3090-31
表达。基于P13KCA的 18位点碱基设计的干扰序列
的效果最佳。
shRNA
关键词:I型P13K 自噬 凋亡
作 者:马人杰
指导老师:邢春根
II
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