VAP-33蛋白在DC及DCS细胞中表达及功能研究.pdf

中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院 中文摘要 我们实验室以前建立的小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞系，经过不同时期不 同方法(形态、免疫组化、表达基因组芯片)的不断验证[李存玺、zhoushixin]， 确立了其为Dc细胞的起源。利用其不同转移能力的克隆找到了在高转移亚系中高 表达的一系列基因。其中包含VAP-33。我们还利用DCS细胞制备了兔多抗，经纯化 后得到了DCS细胞特异的抗体。90年代我们实验室用自制的DCS多克隆抗体，通过 Western 有一特异性条带，并且电镜结果显示该蛋白表达在细胞膜上；本论文进一步提取DCS 右的蛋白条带进行质谱分析，所得肽段蛋白序列输入NCBIBlast，与其序列匹配度 以期明确其在肿瘤侵袭转移中的作用。 本论文分为两部分。 第一部分中，重点观察VAP-33在DCS细胞及DC细胞中的表达及功能。 首先，我们用免疫组化、Western VAP一33的表达进行了研究。最初我们提取DCS细胞的膜蛋白采用质谱技术检测到 细胞表达VAP-33；Western 肺高转移的DDI细胞中VAP一33表达最高。 其次，为了进一步验证VAP-33在肿瘤侵袭转移及肿瘤细胞体外成瘤能力中的 体封闭后的穿膜细胞较空白组及同型对照组都少(仄0．01)，说明VAP一33与细胞 侵袭转移能力有关系；克隆形成率检测该蛋白与细胞体外成瘤能力没有明显关系(p O．05)，说明VAP-33与细胞的增殖无关。 由于DCS细胞来源于DC细胞，而Dc细胞又是重要的抗原递呈细胞，因此，除 了上述对VAP一33与肿瘤侵袭转移关系的研究，我们还对大分子抗原刺激后的DCS 细胞在形态、功能改变等方面进行了研究，其中特别关注了VAP一33的表达变化。 倒置显微镜下观察到随抗原剂量的增加，细胞分支增多变长，细胞更铺展，趋向成 熟DC的形态；Western 激时间的延长而降低；共聚焦显微镜观察到vAP一33在细胞胞浆中的表达更加分散、 均匀。我们预期的结果是随抗原量的增加或抗原刺激时间的延长，VAP_33的表达会 4 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院摹础学院 随之增加或者发生分布上的变化，与实际结果存在偏差。有研究显示，在胞浆中 VAP一33与再循环内体(recycling 循环内体从核周的质膜不断地循环往复协助处理抗原。由此我们推断在该过程中 VAP一33被消耗，或者消耗大于合成的速度，VAP-33有可能参与抗原处理。 细胞中的关系进行了初步探讨。血清饥饿后的DCS细胞经胰岛素刺激后，细胞膜中 VAP一33及GLUT-4的分布发生变化。Westernblotting检测结果显示两种蛋白量的 一结果需进一步利用强迫过表达VAP-33的实验体系进行重复验证。因此我们开展 了下一部分的工作。 第二部分中，为了更好的研究VAP-33在肿瘤侵袭转移中的作用，我们构建了 表达VAP-33CFP融合蛋白的表达载体。根据Gene 起始密码子到终止密码子的前一个密码子，长726bp)设计一对引物，在正反引物 的5，端分别加入XhoI、EcoR I酶切位点及保护碱基。通过RT-PCR技术从DCS细 载体的XhoI／EcoR I酶切位点之间，构建重组载体，经测序该载体构建成功。为 后续实验奠定了基础。 关键词 VAP．33 肿瘤侵袭转移 GLUT-4小鼠树突状细胞肉瘤pECFP-N1 5 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院 Abstract Earlier founda of studies series the highlyexpressedgenes，includingVAP一33，among differentmetastaticDCS