深海细菌Geobacillus+stearothermophilus+TH10中嗜热脂肪酶表达鉴定及体外诱变研究.pdf

摘要 高温酶因理论研究和工业应用上的双重意义受到越来越广泛的关注。研究高 温酶的适应机制不仅有助于解释生命起源问题，而且对于工业用酶的开发有理论 指导作用。 深海热液口作为极端环境的一种，具有高温高压高还原物质等特征，这也意 味着其中蕴含着丰富独特的微生物资源。它的开发对于高温酶的研究具有重要意 义。在生物催化剂的研究和应用中，微生物脂肪酶一直占据着非常重要的地位。 高温脂肪酶因热稳定性好，可以省略一些工业步骤从而大大节约制造成本，已广 泛应用于食品、化妆品、皮革、饲料、废物处理等领域。 我们从深海热液硫化物样品4143．1分离筛选到一株高产脂肪酶菌株THl0， 其最适生长温度65℃，16srRNA鉴定其为Geobacillus。 全长，克隆后于E．coli中重组表达，性质检测结果显示其为高温酶，最适酶活为 8．o_9．0 80℃，即使在90℃仍然保持70％以上的活性。THl0脂肪酶偏碱性，在PH 都有较高活性。在耐受金属离子方面，该酶并没有较大的优势，所有的金属离子 都不同程度的对酶活性起抑制作用。而在去污剂和酶抑制剂存在的条件下，THl0 表现极大的耐受性，tween20和chaps对酶活性都有一定的提高作用。 #eobacillus THl0脂肪酶的三维模拟结构显示，它具有脂肪酶共同的耐B 三层结构，另外，存在一个由2个片状结构和2个a螺旋组成的特殊结构区，是 Geobacillus脂肪酶较保守的区域。温度较低时，该结构区覆盖在催化区起保护作 用。 THIO脂肪酶在用PNP底物检测时表现仅对降解短链脂肪酸链有优势，以 度的提高。 目前，关于Geobacillus脂肪酶的结构研究还不多，而定点突变技术需要建 立在对目的蛋白的清楚认识和理性分析基础上。另外，定点突变改变的氨基酸数 量有限，而蛋白任一性质都取决于多个氨基酸的相互作用。我们也尝试用易错 制易错PCR的错配率在合适的范围，从降解PNP．CIO的能力来看，文库可能包 含有益突变。这一结果有待验证，相关的工作还在进行中。 我们从深海热液硫化物样品筛选到高产脂肪酶菌株GeobacillusTHIO。对其 脂肪酶进行克隆表达，测定了系列酶学性质。GeobacillusTHIO脂肪酶相比其他 已报道的Geobacillus属来源的脂肪酶有更高的热稳定性，是进一步研究嗜热脂 肪酶的高温适应机制和稳定性较好的材料。利用定点突变技术研究了在该嗜热脂 肪酶底物特异性和热稳定性方面起关键作用的氨基酸，并试图通过定向进化的方 法找到能在降解长链脂肪酸方面有优势的突变子。已有的研究将为后期酶学性质 完善提供理论指导依据。 关键词：GeobacillusTHIO；高温脂肪酶；定点突变 Abstract ismoreatrractivenot becauseitisrelatedwiththe Thermophilicenzyme only of alsoduetoⅡleir in isoneof life，but industry origin potential application．Lipase the thatbeststudied．Rhasbeenfoundin and enzyme animals，plantsmicroorganisms． Mostofthe usedin aremicrobial have lipases industry enzymes，whichextensively theirexcellent isaresearch because charac