朊病毒蛋白对细胞自噬影响及可能作用方式.pdfVIP

摘要 朊病毒蛋白(Prion，PrP)因其变构体具神经毒性而备受关注。PrP在神经细 胞中是高表达的，但它的生理病理功能还不是很清楚。细胞自噬是维持细胞代谢 平衡的基本生理过程，同时也是细胞程序性死亡的一种方式。在本研究中，我们 通过在N2a细胞中转染PrP，并检测饥饿胁迫下自噬相关指标，II型微管相关蛋 Protein1 Chain 白1轻链3(Microtubule—associatedLight 3，LC3)的变化；以及自 Protein，Beclin Bcl．2．Interacting 1)的变化，初步探讨了PrP对自噬的影响及其可 能的作用方式。 主要结果如下： 1．构建了pcDNA5．O．mPrP真核细胞表达载体。根据小鼠朊病毒蛋白(Mouse Prion 确；转染N2a细胞后，经Westem blottin鲥ng检测PrP能正常表达，由此构建成 mPrP表达质粒pcDNA5．0．mPrP； 2． Westem 量比对照组下降22％，表明正常生理条件下，PrP能抑制N2a细胞中LC3．I向 LC3．II的转变，从而抑制了自噬的发生；Westem blotting结果显示，转染48h 照组下降26％、63％和64％；利用巴佛洛霉素A1(b瓶lomycinAl，10nmol／L) 抑制自噬溶酶体中蛋白酶的活性，转染空载体的对照中LC3．II／actin的量与未 N2a细胞中LC3．I向LC3．II的转变，从而抑制了自噬的发生； 噬体形成的影响。转染mPrP的N2a细胞中观察到的荧光点明显低于对照组， 对每组50个细胞进行统计分析，发现对照组的荧光点平均为9．5而PrP共表达 组仅为5．2，这一结果在统计学意义上具有极显著的差异(P0．01)，说明PrP 能影响自噬体的形成； 4． 与对照相比，转染48h后，Beclin1的含量相比于对照下降13％；在饥饿胁迫 下，2h，4h，8h时分别比对照组下降16％，8％，5％，这说明PrP不仅在正常 l的含量；免疫共沉淀结果 生理条件下，也能在饥饿胁迫时降低细胞中Beclin 显示，PrP能和Beclin1结合，说明PrP有可能通过和Beclin1互作来抑制自噬； 5． 与对照相比，在饥饿胁迫下抑制白噬能增加PrP的量，说明PrP可作为细胞的 营养储备，在饥饿胁迫时被降解，为细胞生存提供能量；相比于饥饿开始时， 在饥饿胁迫开始时被降解为细胞提供能量，随着饥饿时间的延长，PrP增强 表达以保护细胞； 6．转染6小时候后饥饿18h，PrP23．230的量只有对照PrP1．254的46％， LC3．II／Actin的量却只占其75％，PrP23．230的量很少，但是对自噬的抑制作 用却很明显，说明胞质型PrP可能起主要的抗自噬作用；在细胞中分别转染 23．230，转染后48h时， pcDNA5．0，pcDNA5．O．mPrP，pcDNA5．0．mPrP 23．230对自噬的抑制作用大于全长PrP； 60％，40％；在转染后48h、96h时PrP 说明在正常条件下，胞质型PrP在抗细胞自噬中发挥很重要的作用。 关键词：朊病毒，细胞自噬，抑制 ABSTRACT P晡on isf．amousforthe protein of cytotoxic the PrPSc，but aIld