通过三点饱和突变定向进化AtGSTZ.pdfVIP

摘要 摘要 饱和突变技术通过构建突变文库可以对结构和功能知之甚少的蛋白质特性 的重要方法，也是实验室中改造／优化基因常用的手段。谷胱甘肽巯基转移酶 (GSTs)是一种广泛存在的对细胞有重要解毒作用的蛋白酶家族，具有细胞内 化合物的解毒作用。拟南芥Zeta类谷胱甘肽孓转移酶(么妃STZ)对于自来水中 的强致癌物质二氯乙酸(DCA)具有专一性的降解功能。 在近期的研究中，大量报道集中于保守位点的相关研究，但是保守位点的 突变往往导致酶的失活。本文旨在通过对保守区域内保守位点附近的非保守位 点进行饱和突变，筛选出活力提高的突变株，减少保守位点改变带来的负面影 响。参考已报道的谷胱甘肽孓转移酶关键位点相关研究，通过同源比对，选取 对这三个位点构建AtGSTZs三点饱和突变文库。在三个目的位点处设计兼并引 物，三点饱和突变文库的构建采用交错延伸PCR技术，从该突变库中率选出活 力较高的突变株进行动力学测定。在总共构建的将近一万个突变株的突变文库 中筛选出活力相对于野生型提高超过50％的突变株12株。然后，通过基因序列 分析，得到了活性发生改变的突变体。与野生型相比，该12株突变株中的绝大 多数都显示出在亲和力上相较于野生型的较大提高。通过分析和研究蛋白质分 子的氨基酸序列与其结构、功能之间的关系，我们发现这3个位点都会通过协 同作用产生影响，尤其是通过影响附近相对保守的位点对酶的活力提高产生贡 献。 关键词：饱和突变拟南芥Zeta类谷胱甘肽孓转移酶非保守位点提高酶的 活力协同作用 Abstract Abstract Site—saturation canbedonewithoutsufficient intothe Mutagenesis insight structure-function the of librariesand relationshipsthroughgenerationmutagenesis ofmutantsthat characteristicsjGlutathioneS-transferases screening possess specific 2．5．1．1 a of multifunctional (GSTs，EC8)titlesuperfamily enzymes existing inmostformsoflifeandserveintheintracellulardetoxificationof ubiquitously chemical thalianazetaclass S-transferases substances．Arabidopsisglutathione toward common (AtGSTZs)haveuniquedechlorinatingactivity DCA,a carcinogenic contaminantin Water． drinking Ina siteaboutGlutathioneS-transferasesWas recentlyresearch，somespecial identified someconserved conservedresidues including residu