急性运动轴索型神经病患者血清对体外培养脊髓运动神经元影响比较蛋白质组研究.pdf

中文摘要 急性运动轴索型神经病患者血清对体外培养脊髓运 动神经元影响的比较蛋白质组研究 摘 要 吉兰．巴雷综合症(Guillain．Barr6 组急性或亚急性发病，病理改变为周围神经炎性脱髓鞘或轴 索变性，临床表现为四肢对称性迟缓性瘫痪的自身免疫性疾 病。其病因与发病机制尚不明确。近年随着神经病理和神经 电生理学的进展，将GBS划分为急性炎症性脱髓鞘性多发 吸肌，其主要病理表现为神经轴索变性，神经电生理主要表 现为运动波幅降低。 组时代的标志之一。蛋白质组学可以比较两个或更多的样品 之间蛋白质水平，是揭示疾病分子机制，发现疾病标志蛋白， 寻找新的药物靶标的理想工具。目前仅有少数GBS患者脑 脊液的蛋白质组学研究，尚没有专门针对AMAN细胞模型 的蛋白质组学研究。 本研究应用蛋白质组技术比较AMAN患者与正常对照 组血清对培养的大鼠脊髓运动神经元的影响，旨在发现 AMAN相关蛋白质，以深入理解急性运动轴索型神经病分子 机制，并为寻找早期诊断治疗急性运动轴索型神经病的有效 方法提供实验依据。 中文摘要 方法： 1．血清的获得：选取符合美国国立卫生研究院拟订的 分为AMAN，抽取静脉血离心后获得血清；健康人血清由河 北省血液中心惠赠。所得血清均．800C保存。 2．细胞培养：取S．D大鼠胚胎脊髓腹侧半进行原代体外 运动神经元的分离培养，在培养第6天，神经元生长旺盛期， 给予20％AMAN患者血清进行干预，对照组为正常健康人血 清，2小时后收集细胞。 M 3．蛋白提取：应用裂解液(9urea，4％w／vCHAPS，1％ of w／v andacocktail DTT,O．5％CA inhibitors)，超声 protease 震荡法提取神经元蛋白。 4．双向凝胶电泳：神经元蛋白质以固相pH梯度等电聚 焦为第一向，SDS．PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳。 得到的双向电泳凝胶固定后以镀银或考马斯亮兰R250染色。 2D分析电 5．凝胶图像分析：图象分析软件Imagemaster 泳图谱。比较蛋白质斑点差异，以正常血清干预的双向电泳 凝胶为参考胶，AMAN患者血清干预的凝胶与之比较，根据 斑点的位置、大小、形状等参数，软件自动将不同图谱中的 相同蛋白质点匹配，不能匹配的蛋白质点及表达量上调或下 调超过50％的蛋白质点视为差异点。 6．胶内蛋白质酶解：将蛋白质点从考马斯亮兰染色的凝 25mM 胶上切下后，加入looIJLl NH4HC03／50％乙腈，振荡 除去考马斯亮兰染料，凝胶颗粒用冻干机冻干，应用胰蛋白 酶进行酶切。 中文摘要 患者的血清影响下，培养的脊髓运动神经元发生变化的蛋白 质。 结果： 20％正常人血清干预2小时后，神经元胞体及突起未见 明显改变；20％AMAN患者血清干预2小时后，可见部分神 经元胞体光晕减退，突起变细、回缩。对于每个蛋白质样品， 银染双向电泳凝胶在图像分析软件的帮助下能分辨出1500 个以上的蛋白质点，考马斯亮兰染色则能分辨出600个以上 的蛋白质点。20％AMAN患者血清干预2h的脊髓运动神经 元与20％正常对照组血清干预2h的脊髓运动神经元相比 质谱仪鉴定为不均一核糖核蛋白H、微管蛋白alpha-lA、肌 isomerase、蛋白酶 动蛋白、Delta(3，5)．Delta(2，4)．dienoyl．CoA 体仅亚基l、磷脂酰乙醇胺结合蛋白l、14．3．3蛋白、肽基 kDaheatshock Peroxired