CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶抗体的制备及鉴定.pdf

CTX．M一38型超广谱p一内酰胺酶 抗体的制备及鉴定 郭小兵，代志峰．宋海容，张傅山，叶亚菲 (郑州大学第一附属医院，郑州450052) 摘要：目的制备CTX—M-38型超广谱B一内酰胺酶(ESBLs)抗体，为其后续研究提供实验材料。方法体外表 blot印迹杂交技术，完成抗体滴度检测、抗体纯化及 抗体；分别采用间接酶联免疫吸附试验、辛酸沉淀法及Western blot 000；Western 特异性鉴定。结果SDS—PAGE中约30kD处出现明显蛋白条带；所制备酶蛋白抗体滴度为l：16 印迹杂交显示不同稀释度的抗体均与同一蛋白条带(约30kD)反应，此条带与CTX—M-38型EBSLs蛋白大小相一 致。结论制备酶蛋白抗体滴度及特异性较好，可用于后续研究。 关键词：CTX—M-38；超广谱B一内酰胺酶；抗体 中图分类号：R392文献标志码：A 文章编号：1002-266X(2012)19-0029-03 CTX．M-38型超广谱B一内酰胺酶(ESBLs)是一C小鼠购自河南省实验动物中心。 1．2实验方法 种新发现的CTX．M型酶，具有Bush分类中A类酶 蛋白结构特征¨’2J。从氨基酸序列上看，此酶与 1．2．1 酶蛋白表达、收集与纯化将B121一C1N—hi- mL 38转化子接种于50LB液体培养基中，35℃ crx—M-9型仅存在2个氨基酸位点的替代(Ser220 200 r／min振荡培养2h后，加入异丙基-B—D-硫代吡 Arg和Ala231_+Val)¨1，归属于CTX-M-9组。研 h。收集取菌 喃半乳糖苷并继续振荡培养14—18 究显示，CTX．M-38型ESBLs酶蛋白约由290个氨基 液，洗涤后采用超声破碎法(功率200W，1／2探头， 酸残基组成，PIs介于7．4—9．0，其核苷酸序列与 破碎30s，间歇308)获得酶蛋白。对酶蛋白采用大 TEM型及SHV型ESBLs核苷酸序列同源性较小， 板胶SDS—PAGE电泳，之后进行透析纯化、复性备 与其他CTX—M亚型问同源性亦不高，表明该型Es- IlLs无相应的广谱酶基础，其广谱抗药活性为自身用。 特征，并非点突变引起’4J。我们以往的研究发现， 1．2．2抗体制备、滴度分析与纯化采用传统动物 郑州地区流行的多重耐药大肠埃希菌中也存在着 体‘7JJ。初次及强化免疫均采用72斗g酶蛋白，免疫 CTX．M-38型ESBLs”1。因该型酶其有广泛抗药活 部位选择腹腔，初次免疫采用完全福氏佐剂，强化免 性，早期诊断及有效治疗是阻断产酶菌株流行的关 疫采用不完全福氏佐剂。免疫完成后，采集鼠尾静 键所在。2011年1～1t月，我们采用传统动物免疫 脉血，采用间接酶联免疫吸附试验进行滴度测定，酶 技术完成了CTX．M-38型ESBLs的抗体制备及鉴