Pro167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶的动力学特征.pdf

·250· ．基础免疫学． Pr0167位点突变型CTX．M一14超广谱 13一内酰胺酶的动力学特征 徐荣 尚忠波黄俊伟 韩冬青王震 楼永良 陈秀枢 【摘要】 目的对Pr0167位点突变型CTX—M一14超广谱B一内酰胺酶(ESBL)的动力学特征进行 分析与评价。方法以携带CTX—M一14基因的大肠埃希菌临床株为模板，克隆目的基因，重组工程 菌，并表达crx—M·14型ESBL。进而采用基于重叠延伸PCR法的定点突变技术，将CTX-M-14型 P167S和P167T四株突变型的CTX-M-14工程菌。表达与纯化野生型、重组型和突变型CTX．M-14型 ESBL，检测其水解B一内酰胺类抗菌素的酶动力学参数(j，叫、足。和K。／K．)。结果对野生型与重组 型CTX-M-14型ESBL的酶动力学参数进行配对t检验，结果显示两者k(t=1．796，P=0．123)、民 CTX-M-14型ESBL相比，P167S突变型酶对头孢他啶的民值大幅降低，为突变前的1／16(8．39／ 134．85)；k和k／k值分别为突变前的2．87倍(1．8I／0．63)和43．6倍(O．218／0．005)；且对青霉 素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松和头孢噻肟的k／值都呈现出显著减小的趋势(P 0．05)。与重组crx-M-14ESBL相比，P167Q和P167G突变型酶对头孢他啶的K。值亦大幅减小(P 0．01)，而P167T突变型对头孢他啶的酶动力学参数无明显变化。结论重组型与野生型CTX·M一 14ESBL之间各项酶动力学参数的差异无统计学意义(P0．1)。而P167S位点的突变，不仅增强了 CTX—M一14型ESBL对头孢他啶的亲和力，也加快了酶一底物复合物的转换速率。通过对Pr0167位点4 种突变型酶的动力学参数比较，初步说明突变型CTX-MESBL对头孢他啶所具备的高水解活性机制， 不能简单地归结于Pr0167位点被小侧链氨基酸残基取代而导致酶活性中心空间扩大的解释。 【关键词】超广谱B-内酰胺酶；crx-M；突变；酶动力学 ’nedaaracteristicsof kineticsof enzyme aⅨ-M-14typeextended-spectrum13-lactamase啊m Prol67residue substitution XU舶昭，鲫隗ⅣcZhong-bo，HUANGJun-wei，珊NDong．qing，WANG Xdu．sh玑Institute Clinical Medicine Zhen．LOUYong-liang．CHEN ofM洒∞cology-Schoolof Laboratory and Science．WendmuMedwal 325035。China Life College．Wenzhou author：cHENXiu-shu．Email：bull．chen@126．com Corresponding To andevaluatethecharacteristicsof kineticsofCTX．M．14 【Abstract】oMectiveanalyze enzyme Pml67residuesubstitution．Methodsmolecularclo- typeextended-$p6虻trulnB—lactam删(ESBL)witlI By andPCR was clonedinto clini． Iling techniques。CTX-M-14gene directionally plasmidpET28a(4-)froma ealEeo／iisolateandformedan vectortotransform Ecoil expression competentB121(DE3