DNA印迹和杂交技术.ppt

第三节 核酸分子杂交技术 DNA印迹与杂交技术 RNA印迹与杂交技术 一、 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 （一）DNA变性与复性 核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 三、Southern blotting DNA印迹与杂交 1975年，英国Edwen Southern创建 定义：检测DNA杂交方法，即将DNA电泳分离、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析 基因诊断、分子克隆、法医学等 Southern bloting的主要步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 1. 待测DNA样品的制备、酶切 DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。 2. 待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳 3. 凝胶中DNA的变性：碱变性 五、 其它分子杂交方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 （二）斑点印迹杂交(dot bloting) 将RNA或DNA变性后直接点样于纤维素膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 缺点：特异性不高、不能鉴别核酸分子量 应用：确定DNA样品之间的同源性 （三）核酸原位杂交(in situ hybridization) 1. 定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。 2. 特点： 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 1. 细胞或组织的固定：载玻片 2. 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 3. 探针的选择和标记 4. 杂交 5. 杂交结果检测 1. 荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2. 多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH ) 3. 比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。 CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。 （四） Western 印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移： 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 （五）液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 5、Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA