海洋来源酶的应用.docVIP

海洋来源酶的得到和应用 （青岛科技大学 化学与分子工程学院，山东，青岛，266042） 摘要：海洋因其独特的高盐、高压以及低温环境，决定了海洋酶与陆地酶在很多方面都不相同，随着海洋酶的不断发现及其在生产生活中的应用，海洋酶正在起着越来越重要的作用。本文以琼胶酶为例，讲述了海洋来源酶的得到的过程，及其在日常生产生活中的应用。 关键词：海洋来源酶，得到，应用，琼胶酶 酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点1 琼胶酶的种类及作用机理 1.1 琼胶酶的种类[1] 根据作用方式，降解琼胶糖的琼胶酶可分为2类：(1)α-琼胶酶：裂解琼胶糖的α-1,3 糖苷键,生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖(agarooligosaccharides)系列。(2) β-琼胶酶：裂解琼胶糖的β-1,4 糖苷键,生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖(neoagarooligosaccharides)系列。 1.2 作用机理 早期研究表明，琼胶酶有两种不同的作用机理。第一种作用机理是在研究Pseudoalteromonas atlanticaATCC 19292 的胞外β-琼胶酶时发现的。首先，琼胶聚合物的β-1,4 糖苷键被内切β-琼胶酶裂解，形成以新琼四糖为最终产物的寡糖混合物。这些寡糖混合物再被外切的β-琼胶酶水解，生成新琼二糖。最后，新琼二糖水解酶在细胞质内将新琼二糖水解成3,6-内醚-L-半乳糖和半乳糖。第二种机理是琼胶糖的1,3-糖苷键被胞外的α-琼胶酶裂解,生成以D-半乳糖为非还原末端的琼二糖系列[2]。 2 琼胶酶的来源 琼胶酶主要通过海洋微生物得到。1902年Groleau第1次从海水中分离到能分解琼胶的细菌－琼胶假单胞菌。从那以后人们已经从海水系统中分离到了多种琼胶分解菌，包括Pseudomonas(假单胞菌属)、Pseudoal teromonsa(假别单胞菌属)、Strept-omyces(链霉菌属)、Alteromonas(别单胞菌属)Microscilla、Vibrio(弧菌属)、Cytophaga(噬细胞菌属)等。如Leon（1992）分离出了一株别单胞菌，Araki(1998)等分离出了一株高产琼胶酶的弧菌并纯化了胞外酶；杜宗军（2002）等分离出了两株塔式弧菌；褚艳等（2003）分离出了一株假单胞菌，并进行了培养条件优化等。除微生物，琼胶酶还可以从一些以海藻为食的海洋动物的肠道中分离得到，海兔属( Aplysia dactylomela ) 、鲍属( Haliotis coccinea ) 、滨螺属( Littorina striata) 、冠海詹属( Diadema antillarum )中可分离出琼胶酶[3]。吴永沛等（2002）采用(NH4)2S04 分段盐析和葡聚糖柱层析存化技术，从九孔鲍内脏器官中提取存化了琼胶酶[2]。 3 琼胶酶的提取过程 3.1 细菌分离与纯化[4] 在含有琼胶的海藻（石花菜、江蓠）的周围取一定量的海水，将海水均匀的涂到琼胶平板上，将平板放在适宜的温度下，观察细菌的生长状况．菌落周围出现凹陷的细菌即为产琼胶酶的海洋细菌。将凹陷中的细菌取出稀释后再涂于琼胶平板上，菌落周围出现凹陷的细菌即为产琼胶酶的海洋细菌，这样可以进行进一步的纯化。 3.2 DNA的提取与重组质粒的获得[5] 将纯化的细菌在琼胶平板上进行大量的培养，制成细菌饱和溶液，用离心机进行分离提取细菌的DNA,用不同的限制性内切酶将细菌的DNA切成不同的片段，然后将这些片段进行PCR扩增，用切割细菌DNA的限制性内切酶切某细菌的质粒，将质粒与细菌的DNA片段相连接，得到重组质粒。 3.3 琼胶酶的获得[5] 将所有的重组载体导入到一种能够将琼胶酶分泌到外部的细菌中，将细菌在琼胶平板上培养，如果出现水解圈说明该细菌中已经导入能够产生琼胶酶的基因，将该细菌进行稀释再在琼胶平板上进行培养，使该细菌纯化，选择水解圈大的细菌群落，这样的细菌生产琼胶酶的效率比较高。将该细菌进行大量培养再加外界条件刺激，就可以得到大量的琼胶酶。 4 琼胶酶在生产生活的应用 4.1 制备琼脂低聚糖[2] 琼胶酶降解产生琼胶低聚糖，具有高效性和专一性的特点,而且降解条件温和，水解产物不易被破会，利于产物分析和回收，因而逐渐代替了传统的酸解法。由于琼胶低聚糖具有多种特殊功能而倍受关注，主要如下： 4.1.1 作为天然防腐剂 琼脂的酶解产物琼脂糖，具有较强的抑菌作用，在浓度达3.11%时，能有效的减少菌落产生，因此是一