蛋白质的定量法与标准曲线的制备.docVIP

蛋白質的定量法與標準曲線的製備 A. Folin-phenol(lowry method)定量法 此法以Biuret方法反應為基礎發展而起，因此會嚴重干擾Biuret測定方法的因子都會影響此測定法的準確度。這些干擾因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基團的物質以及緩衝劑如Tris、蔗糖、低濃度的酚類、檸檬酸等，但低濃度的尿素、硫酸胺可以增加碳酸鈉-氫氧化鈉的濃度來校正顯色結果。1951年Lowry對於 Folin-Ciocalteu 試劑在不同的 pH值條件下得到此試劑作用的最佳反應條件，此法的靈敏度較Biuret方法高約100倍，反應時間只要約15分鐘即可顯色，顏色的穩定度可達數小時，故目前多用Folin-phenol法測定待測樣本的蛋白質濃度。 原理：蛋白質與Folin試劑作用分成兩個階段： 蛋白質 先與鹼性銅離子作用 Cu2+ + Protein- Cu-Protein 當鹼性的銅離子試劑和蛋白質中的 peptide bond反應時會產生biuret test 的初步呈色反應，此蛋白質銅複合物會再由Phosphomolybdic-phosphotungstic試劑(Folin-Ciocalteu Reagent)作用形成藍色物質。 蛋白質分子中可和Folin – Ciocalteu 試劑作用的團基有：Histidine的Imidazole Group、Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group、Cysteine的Sulfhdryl Group、Arginine的Guanidino Group。在這些團基中，Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group最為重要，鹼性蛋白質與Folin-Ciocalteu Reagent複合物的顏色強度與蛋白質中的芳香族官能基 (aromatic group) 成正比。 值得注意的是當Folin-Ciocalteu 試劑在強鹼的環境中易使 phosphomolybdate解離而喪失作用的能力，所以此劑須新鮮配製並避免與蛋白質中的 Tyrosine 及 Tryptophan 反應前置於強鹼的環境中，依比色的方法測其吸光度，換算蛋白質的量。 注意 Folin-Ciocateu phenol 試劑在酸性環境中才穩定，但 Lowry method 必須在 pH=10 才會發生，所以 Folin - Ciocalteu Reagent 一加入鹼性的硫酸銅-蛋白質溶液中(alkaline cooper protein )必須馬上混合均勻，以確保還原反應在phosphomolybdic- phosphotungstate 分解之前發生。 以上兩種蛋白質顯色定量法均會破壞樣本中的蛋白質，故當蛋白質樣本量少又需要回收時，不可以使用此種方法定量。 B.紫外線吸收值測定法 由於蛋白質分子中多含有芳香族胺基酸（如苯丙胺酸(phenylalanine)、色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine) ）殘基，這些殘基含有具共軛電子的苯環團基，故在紫外線波長280nm、260nm會有吸光值。在波長280nm之吸光值與蛋白質的濃度具正相關性，故可以利用280nm的吸光值做為蛋白質的定量工具。此法的優點是迅速、簡便，不消耗樣品及不受低濃度的鹽類干擾。但此種測定方法的缺點是，許多其它物質在此波長附近亦有吸光現象，如核酸雖在260nm會有最大吸光值，但在280nm處仍會有吸光的現象。一般而言，純的蛋白質之280nm/260nm比值約1.75，但此數值會依蛋白質含方香族胺基酸含量而變，因此利用此方法測定蛋白質的濃度最大的缺點是，對於測定那些與標準蛋白質中色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine)含量差別大的蛋白質，測定的濃度會有一定的誤差；再者，樣品中如果又含有核酸等吸光物質時亦會出現大的干擾。因此待測樣本或標準液在作適當的稀釋並在波長280nm及260nm測得吸光值後，可以利用下列的公式以校正蛋白質的濃度。 公式： 蛋白值濃度(mg/ml) = 1.45A280 - 0.75A260 Folin-phenol(lowry method)定量法 A. 試劑與儀器： 溶於 1. reagent A：100g NaCO3 1L 0.5N NaOH 。 溶於 2. reagent B： 1g CuSO4?5H2O 100mL ddH2O。 溶於