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分子生物学论文 姓名：张芳明 学院：园艺学院 专业：果树学 学号基于分子理论对适合PCR技术的高效提取真菌DNA的 试验计划的简单改进 摘要：选取培养了3-4 d的镰刀菌，黄萎病菌，蠕菌和水稻纹枯病菌的菌丝5 ㎎在混合裂解缓冲液中微波处理，直到提取到9091 ng /ｕｌ的基因组 DNA。通过用美国国立生物技术信息中心镰刀菌和黄萎病物种鉴定的顺序匹配系数来分析基因的翻译伸长特点，并且通过水稻赤霉恶苗病菌卫生和植物检疫赤霉素生物合成基因集群对类似于细胞色素p450-4的fum5通过伏马菌素产物PKS系统的高效的具体基因特点分析证明得到的基因足够做PCR分析实验。我们提出了一个非常简单的真菌DNA的提取方法，这个方法通过减少昂贵化学药品如CTAB,SDS等的用量来提高速率和成本效益。而通过这个方法得到的DNA 的数量与经典的和利用试剂盒提取DNA的方法相比是完全占有优势的。并且这个提取方法对DNA的指纹图谱分析，转化和核酸印迹原位杂交是相当适合的。 关键字：水稻恶苗病菌；黄萎病；PKS；CTAB 引言 对于以DNA为基础的分子生物技术的各种研究工作来说得到大量的DNA是最主要的目的。在现代的研究环境下，几十种新的试验计划已经提出来了，这些试验计划有O’Donnell和Sreenivasa等提出的为了减少时间限制像基于CTAB的提取方法，有Laday等提出来的线粒体DNA的提取方法，和Leach等提出的整个DNA的提取，还有许多研究者阐述的从不同的丝状真菌中提取DNA的方法。Moller等阐述了镰刀菌的DNA的提取方法。虽然通过这些方法获得的DNA的数量和质量是让人非常满意的，但是这些技术非常耗费时间，还使用了像苯酚，氯仿，一疏基乙醇等的有毒化学物质，并且这些技术也非常麻烦。尽管有很多可利用的提取真菌DNA 的技术，但是通过这些试验程序来提取一些真菌菌丝体和大多数的真菌孢子的DNA还是很棘手的。 最近，Fujikawa和Tendulkar等已经提出了利用微波来从大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌中提取质粒和DNA的方法,他们报道说通过微波辐射的方法来隔离稻瘟病菌的真菌DNA。虽然这个方法非常简单，但是这个方法在其他真菌如镰刀菌，蠕菌，水稻纹枯病菌上观察不到重复性和一致性。尽管已经证明微波处理的方法在获得植物，动物细胞和真菌如 的DNA上是非常有效的，但是在PCR增殖的预处理上使用苯酚和氯仿是这一试验的最大的缺陷。这就需要我们发展一种不使用上述化学物质的新的试验计划。目前，研究的目的是能从普遍使用的真菌来获得真菌DNA的简单有效的试验计划。我们修改微波处理并加上裂解缓冲处理从上面提到的真菌中获得大量的DNA。 材料和方法 真菌培养： 真菌是在PDA基质中生长和培养的。并且所有的真菌都是在PDA液体基质中分别培养，PDA基质中的真菌生长环境是被调控的，在24-26 ℃的温度条件下，真菌被连续的荧光照射6-7天。在真菌培养的第7 d，用血细胞计数和接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基上的浓度为1.104的孢子悬浮液来计算真菌的菌落总数。 真菌菌株是从意大利西北部的水稻生长地区的被感染的水稻样本上分离的到的。两个代表，ITEM504和ITEM1720的菌株是从意大利巴里的科学食物生产研究所的培养中获得的。 Moller等提出的修改的CTAB法提取DNA的方法：从PDA培养基上刮取50 ㎎培养了10 d的真菌菌丝体，加入500 ｕｌ的已经预热到60 ℃的TES裂解缓冲液，用微杵研磨，放到1.5 ml的离心管中手动离心。在材料中再加入50 ug的蛋白酶K，在60 ℃的温度下孵育60 min。在悬浮液中再加入5 M的Nacl 140 ug 和 10 %(w/v)的CTAB 64 ul 在65 ℃的条件下孵育10 min。再加入相同体积的氯仿：异丙醇（24:1）混合液在1400 xg/10 min的条件下离心，就可以得到DNA片段。然后加入0.6 vol的冷异丙醇和0.1 vol的PH 5.2的3 M的醋酸钠，并且保持在-20 ℃的条件下，离心机离心并用70 %的乙醇冲洗两次，悬浮在100 ul的TE溶液中。加入10 mg/ml的RNA酶 A酶切RNA，并且在37 ℃的条件下孵育45 min，保存在-20 ℃的条件下备用。 试剂盒的方法提取DNA：通过使用者指导手册利用核苷酸自旋DNA提取的设备来提取了所有的真菌DNA。 裂解缓冲微波处理提取DNA：从培养了4-7 d的PDA培养基上刮取5-10 mg的真菌菌丝体，用奶酪布过滤液体培养基，加入500 ul的TES裂解缓冲液，在1.5 ml的离心管中人工研磨，然后再28 ℃的条件下以800 W的频率微波处理15 s，接着在60 ℃的条件下孵育30 min,再在1000 xg/5 min的条