Westernblot实验技术讲义抗体大王分享.pptVIP

Western blot 实验技术 巴傲得生物上海分公司 金永红 4006609091 king@ 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot基本原理 Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 洗涤 二抗杂交 洗涤 底物显色 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 蛋白样品的制备 细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液在离心，收集上清液，加loading煮样5min 蛋白样品制备的注意事项： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且 每单位重量的蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素 纯净水 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? SDS Tris-HCL TEMED 过硫酸铵 凝胶成份 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度％ （W/V） 分离范围（bp) 3.5 5.0 100-2000 80-500 8.0 12.0 60-400 40-200 15.0 20.0 25-150 6-100 30.0 6以下 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项： 做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。 加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散 电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到85V开始电泳，待marker出现6条带时将电压调到135V，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。 转膜 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。 转膜注意事项： 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用转移buffer浸泡20min 转膜顺序： 阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板 转膜：0.35A 250V 1h40min 封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深