HPLC测定丹皮中丹皮酚在大鼠体内血药浓度及药动学研究.docVIP

HPLC测定丹皮中丹皮酚在大鼠体内血药浓度及药动学研究 陈晓兰1，2，，杜守颖(，北京中医药大学北京 100102） [摘要]　目的 建立测定大鼠血浆中丹皮酚浓度的HPLC法，并用于丹皮酚注射给药后在大鼠体内的药动力学研究。方法 采用水蒸汽蒸馏法提取丹皮中的丹皮酚，大鼠尾静脉注射4mg/kg丹皮酚，于给药后不同时间采集血样，用乙腈处理血浆样品，震荡离心分离上清液用HPLC测定。选用色谱柱DiamonsilTM钻石C18（4.6 mm×250，5 μm）=60 : 40，流速为1.0mL /min，检测波长为274 nm，柱温为常温，进样量为20μL。结果 标准曲线线性范围0.204～20.4 μg·mL - 1，r =0.999 9。丹皮酚平均回收率92.27％，最低检测浓度为10ng，最低定量限LOQ为0.204μg·mL – 1，日内、日间RSD4.9％。丹皮酚血药浓度数据用药动学软件kinetica处理，丹皮酚在大鼠体内的血药浓度一时间过程符合二房室模型，AUC=111.88±14.44μg·mL – 1 ·min- 1，MRT=23.25±5.86min，Cmax=8.99±0.84μg·mL – 1， Kel = 0. 082±0.015min–1， t1/ 2 Kel= 8.73 ±1.54min。结论 该方法简便、快速、重现性好，适用于丹皮酚大鼠血药浓度测定及药代动力学研究。 [关键词] 丹皮酚；HPLC；血浆；药动学参数 丹皮酚为中药牡丹皮(芍药科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.根皮)的主要活性成分，药理活性广泛，具有抗心律失常、抗高血压、抗血栓、免疫调节及抗肿瘤作用 [1 ]。药理学研究证明丹皮酚能显著降低脑缺血再灌注后期脑组织NOS活性，减少脑组织与血浆NO 和ET生成，以此对脑缺血损伤发挥保护作用[2]。近年来对丹皮酚的体内药动学研究报道已不鲜见[3~5]，但对丹皮酚在大鼠体内血药药动学的研究较少，为了进一步研究丹皮酚在大鼠体内血药药动学的情况，本文建立了HPLC法测定大鼠血浆中丹皮酚浓度的方法，采用乙腈沉淀蛋白法，该方法简便、快速、重现性好；并通过对静脉注射给药后丹皮酚在清醒大鼠体内药动学的研究，旨在探索其在动物体内吸收、分布、代谢和排泄的规律。 材料 1.1 仪器与试剂 岛津LC-10AD液相色谱仪；岛津SPD-1020A检测器；CX-100 型超声波清洗器（北京医疗设备厂）；赛多利斯BS 110S 型电子分析天平（北京赛多利斯公司）； 丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号110708-200505）；丹皮酚(由本实验室采用水蒸汽蒸馏法提取所得，纯度98％)；甲醇（promptar公司，色谱纯）；乙腈（promptar公司，色谱纯）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团）；其它试剂均为分析纯。 1.2 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重250±20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号： SCXK（京）- 2006-0009) 。 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsilTM钻石（4.6 mm×250，5 μm）=60：40，流速为1.0mL /min；检测波长为274nm；柱温为常温；进样量为20 μL。 2. 2丹皮酚对照品溶液的制备 精密称取丹皮酚对照品5.1 mg于10ml量瓶中，用色谱乙腈制成0.51 mg/ml的丹皮酚储备液，置于4 ℃冰箱中保存。 2.3血浆样品的采集 清洁级SD大鼠5只，雄性，体重250±20 g，禁食不禁水12h后，采用静脉注射( iv)途径给予丹皮酚4mg/kg。在乙醚麻醉下，将毛细管插入眼底静脉分别于给药后0.5、1、3、5、 10、 20、30、45、60、90和120min取血0.4ml于肝素浸润过的试管中，采集完毕后，10000 r/min离心10min，取血浆置- 20℃冰箱保存备用。 2. 4 血浆样品的处理 精密量取血浆样品0.1ml，加入乙腈0.3ml，涡旋混匀1min，10000 r/min离心10min，取上清液约0.1ml置于进样瓶中，HPLC自动进样。 2.5 数据分析 采用标准曲线法计算血药浓度，血药浓度数据用药动学软件kinetica处理，计算注射给药后丹皮酚在大鼠体内的药代动力学参数。 2.6分析方法的确证 2.6. 1 分析方法专属性　在上述色谱条件下，丹皮酚的保留时间约为11.5 min，理论塔板数大于8 000。空白血浆的内源性物质对丹皮酚的测定无干扰，见图1。 A.空白血浆；B.丹皮酚对照品；C.给药后血浆样品；1.丹皮酚 图1 丹皮酚的HPLC 图 2. 6. 2 标准曲线　分别于离心管中加入空白血浆0.1ml，以倍比稀释2.2项下的丹皮酚对照品溶