黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体DNA的分离纯化定稿.docVIP

*黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体DNA的分离纯化 肖贵榜1，2葛正龙2张艳磊2李作祥3 （1.遵义职业技术学院，贵州 遵义563000；2.遵义医学院 生物化学与分子生物学教研室，贵州 遵义563003；3．贵阳职业技术学院 生物化学工程系， 贵州 贵阳550081） [摘要] 用差速离心法和改进的碱裂解法分离纯化遵义小钝吻鮠（Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.）线粒体DNA, 紫外检测其OD260/ OD280在1.78～～ [文献标识码]A 鱼类居于脊椎动物中较原始的地位，但其种类繁多，数量极其庞大[1]。鱼类为人类提供了质量极佳的蛋白质营养。人们对鱼类的研究已极为广泛，在遗传方面，传统的形态标记、细胞学标记和同工酶分析等已成功地应用于多种鱼类的种群识别[2] [3]。鱼类mtDNA为共价闭环的双链 DNA , 分子大小15 561~18 705bp之间 [4] ，是鱼类唯一核外遗传物质，具有基因组结构简单，进化速度快，母系遗传和在世代传递过程中不发生重组等特性，自上世纪80年代以来成为群体遗传分化和追溯母系起源的一个良好模型。由于上述特点，以mtDNA作为分子标记，探讨鱼类的群体遗传结构与系统演化，已成为鱼类分子群体遗传学和系统学研究中的热点。遵义小钝吻鮠（Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.）[5]隶属于鲇形目鲿科鮠属，黔北最为名贵的野生经济鱼类之一，在当地颇受人们青睐。为了进一步研究其在分类上的地位及其和相近种属鱼类的亲缘关系，我们首次提取了该鱼线粒体DNA，以期为后续研究工作提供科学依据和基础资料。 1材料与方法： 1.1试验材料 试验用鱼为黔北洛安江一野生鮠属新种遵义小钝吻鮠（Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.）。鱼体长80.26 mm～mm(95.6±9.692)，体重20g～ 10 mM Tris-Cl(pH8.0) 0.1M NaCl 1mM Na2EDTA (pH 8.0) 蒸汽高压灭菌后保存于4℃备用。 SE：0.25M蔗糖 30mM Tris-Cl(pH8.0) 10mM Na2EDTA 2.5mM CaCl2 CaCl2应配成的贮存浓度，且须过滤除菌保存于4℃备用。 TEN（10XTEN）： 0.1M Tris-Cl(pH8.0) 0.01M EDTA (pH 8.0) 1M NaCl 1%SDS含0.2 M NaoH(用20%SDS和10 M NaoH新鲜配制。) KAc应用液： 60mL5 M KAc溶液、11．5 mL冰醋酸、28．5 mL蒸馏水。 应先配制5 M KAc贮存液低温保存备用。 氯仿：异戊醇： 体积比为24:1。 除20%SDS无需灭菌，NaoH用塑料容器室温保存外，其余试剂（包括贮存液）最好灭菌置低温环境保存。另需准备Tris饱和酚（北京索莱宝），无水乙醇。 ②冰浴环境：在不漏水隔热箱内置入经-20℃保存10小时以上的冰袋，并加入适量的0—4℃的干净冰水，最终使其内部温度保持在4℃以下的冰盒.通常准备两个较大冰盒。预冷解剖用具。将剪刀、镊子、小烧杯及各种离心管预冷。预冷玻璃匀浆器，并向玻璃匀浆器玻棒内注入0—4℃干净冰水，匀浆器装配好后置入冰浴中预冷。使用电动匀浆需准备预冷的50ml离心管。 ③提前15min启动Eppendorf高速冷冻离心机。水平放置电子天平并调零。 1.2.2 肝脏线粒体提取步骤 ①将去血后的鱼体由鳃后腹部左右两侧解剖鱼体取肝。小心移去胆囊后剔除结缔组织。肝脏称重后置冰冷小烧杯中用鱼用生理盐水冲洗，经STE漂洗3次，剪碎后按重量与体积之比1：8移取SE用玻璃匀浆器匀浆或电动匀浆；②匀浆液转入2mlEppendorf管以2℃，3000r/ min离心10min；弃沉淀，小心将上清液转移至预冷的1.5mLEppendorf管（每管1ml），2℃，12000r/ min离心15min；沉淀即为粗提线粒体；③将沉淀用6mlSE悬浮均匀，1．5 mL的Eppendorf管分装，以2℃，12000r/ min离心10min；沉淀即为纯净线粒体。 1.2.3线粒体DNA的分离 ①向获取的线粒体中加入150μlTEN将沉淀吹打均匀后加 300 μl 新配制的含1％SDS含0．2 M NaOH的溶液,上下翻转几次混匀 ,冰浴 10 min.再加 225 μl冷KAc应用液(4 ℃) ,上下翻转几次混匀 ,冰浴 30 min. 12000r/ min离心 8 min ,取上清液计数约600 μl—800 μl ,此即线粒体 DNA提取液