基因工程复习重点.docVIP

绪 论 1.理论上的三大发现： （1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。 1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。 2.技术上的三大发现: （1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ） （2）DNA连接酶的发现（1967Gellert） （3）基因工程载体的发现 3.基因工程研究的内容： (1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 (2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。 (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。 (4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。 (5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。 (6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析； (7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 第二章 基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶 1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制 修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。 2．核酸内切限制酶的类型 ：I型、II型、III型 3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统 4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。 一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。 二、切割类型： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 三、产生的末端特征： 1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（平末端的DNA片段则不易于重新环化。）2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。 3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。 四．影响核酸内切限制酶活性的因素： (1) DNA的纯度。 提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 (2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 (3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。 (4) DNA的分子结构 (5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。pH=7．4时，最佳 1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别