DNA化学合成的应用.pdfVIP

中国试剂网 3.9.15 DNA 化学合成的应用 随着 DNA 合成技术的发展，特别是自动化合成技术的引入，人们能简便、快速、 高效地合成其感兴趣的 DNA 片段。目前，DNA 合成技术已成为分子生物学研究 必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日 益发挥重要的作用。 1.DNA 合成在基因工程和分子生物学研究中的应用 1.1 合成基因 目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以 根据需要合成出具有实际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。已报道的合成基 因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素 II、集落刺激因 子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。我国上 海生物化学研究所等单位于 19841 年首次在世界上合成了具有生物学活性的酵 母丙氨酸转移核糖核酸，为人类文明作出了应用的贡献。 目前，合成基因的方式有2 种。①全基因合成：一般对于分子较小而又不易 得到的基因采用该方式。可将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成 基在在 100 个核苷酸以上时) ，每个片段长度控制在40～60 个碱基，并使每对相 邻互补的片段之间有～6 个碱基交叉重叠。在体外将除基因两端末端外的所有片 段磷酸化。混合退火后加入DNA 连接酶，即可得到较大的基因片段。如果需连 接亚克隆的方法，最后将亚克隆的较大片段重组为完整的基因。采用分步连接、 亚克隆的方法时，为便于亚克隆中回收基因片段。应在片段两侧设计合适的酶切 位点，由于每个亚克隆可以分别鉴定，从而可减少顺序错误的可能性。②酶促合 成：此法又称基因的半合成。全基因，特别是较大的基因的全部化学合成成本昂 贵，使用半合成的方法可以降低成本，从而利于普及使用。首先合成末端之间有 10～14 个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在 4 种 dNTP 存在的条件下，通过 DNA 聚合酶 I 大片段(Klenow 酶)或反转录酶的作用，获得 两条完整的互补双链。在合成基因的结构中，应包括有克隆和表达所需要的全部 信号及 DNA 顺序，基因密码的阅读框架也应该同表达体系相适应。此外，由于 不同种类的生物体或密码子的使用都具有明显的选择性，在基因合成和克隆时必 须考虑这个问题。选择合适的密码子，以获得高效表达。 中国试剂网 3.9.15 1.2 合成探针 基因的克隆和分离已成为现代分子生物这研究必不可少的手段。DNA 合成 技术在其中起着越来越重要的作用。它不仅使得过去颇费周折的基因筛选与鉴定 成为常规技术，而且使得克隆载体的构建及克隆基因和载体的连接变得更加容易 和准确。蛋白质的结构可以通过 mRNA 的结构间接地得出。相反，如果已知某 个肽段的氨基酸顺序，也可根据密码简并的原则推导出所有可能的 mRNA 序列 密码。人工合成的具有特定顺序的寡聚DNA 片段，已应用于筛选和鉴定重组质 粒或 λ 噬菌体。实验证明用合成的寡核苷酸片段，即使只有 1 对碱基错配采用严 谨条件杂交也能与完全互补的双链相区别。因此，使用作探针的寡核苷酸，应将 密码的简并度调至最高限度时，可减少假阳性，增加筛选的准确率。 1.3 合成引物 1.合成 PCR 引物进行基因扩增：PCR 技术是 80 年代中期发展起来的一种体 外扩增特异 DNA 片段的技术。该法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百 万特异 DNA 序列拷贝。PCR 技术的特异性取决于所用引物和模板 DNA 结合的 特异性。合成引物在PCR 反应中的使用。 2.序列测定用引物：DNA 序列测定是分子生物学中最重要和最精细的研究 技术，其中最常使用的是末端终止法，即是一种依赖于特异DNA 引物的序列测 定方法，此外该法对模板的需要量较大，这就要求待测DNA 片段尤其是拷贝数 少的片段首先克隆到适合的载体中经过扩增后进行序列测定。常用的克隆载体如 M13 、pUC19 、PBR322 等均可购到有商品出售的公用测序引物。 3.合成导入突变用的引物：利用寡核苷酸引导的突变，可在目的 DNA 序列的任 何部分产生点突变、插入和缺