EST技术及其在基因全长cDNA克隆上的应用策略.pdfVIP

中国试剂网 3.17.4.3 3.17.4.3 EST 技术及其在基因全长 cDNA 克隆上的应用策略 第二军医大学细胞生物学教研室；上海 200433 何志颖；姚玉成（综述）；胡以 平（审校） 关键词：EST 技术；“ 电子”基因克隆；生物信息学；基因 摘要： 随着人类基因组计划的顺利进行，EST 技术被广泛应用于基因识别、绘 制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域。利用人类基因组研究不断产生的数据， 从 ESTs 即 cDNA 的部分序列入手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长 cDNA 序列，避免或减轻了构建与筛选 cDNA 文库等繁锁实验室工作。本文从原理、 应用及其在科学研究上产生的影响等方面对 EST 技术进行了概述。 表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs ）是指从不同组织来源的cDNA 序 列。这一概念首次由 Adams 等于 1991 年提出。近年来由此形成的技术路线被广 泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显 著成效。在通过 mRNA 差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的 cDNA 部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长 cDNA 序列，以便对该基因的功 能进行研究。克隆全长 cDNA 序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选 cDNA 文库，或采用 PCR 的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点 已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。而随着人类基因组计划的开展，在 基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这 些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已 成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达 序列标签（ESTs ）序列，获得基因部分乃至全长 cDNAycg，将为基因克隆和表 达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。文本 将就 EST 技术的应用并就其在基因全长 cDNA 克隆上的应用作一较为详细的介 绍。 1、ESTs 与基因识别 EST 技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效 率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有 2% 的序列编码蛋白 质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编 码蛋白质的 mRNA 出发，构建各种 cDNA 文库，并对库中的克隆进行大规模测 3.17.4.3 序。Adams 等提出的表达序列标签的概念标志着大规模 cDNA 测序时代的到来。 虽然 ESTs 序列数据对不精确，精确度最高为 97%，但实践证明EST 技术可大大 加速新基因的发现与研究。Medzhitov 等通过果蝇黑胃 TOLL 蛋白进行 dbEST 数 据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析 的方法，找到相应的人类同源 EST （登录号为H48602 ），这为接下来研究人类 TOLL 同源蛋白的功能提供了很好的条件。hMSH5 基因是从酿酒酵母菌 MSH5 存在 30%的一致性，它与hMSH4 特异性相互作用，在减数分裂和精子发生过程 中发挥一定的作用。由此可见，应用 EST 技术，可以跳过生物分类学的界限， 从生物模型的已识别基因迅速克隆出人和小鼠基因组相应的更复杂的未知基因。 生物间在核苷酸水平上的进货差异阻碍了传统意义上的杂交或以 PCR 为基础的 基因克隆策略，即使是亲缘关系很接近的生物也不例外，如 C.elegans 和 C.briggsae，它们仅在2～5 千万年前分化形成。而通过计算机进行 dbEST 进行数 据库筛选，其配制是电子杂交实验，提供了一条更为广泛的基因识别路线，这一 路线允许基因组间存在差异，这使得基因识别与新基因克隆策略发生革命性变 化，同时它也提供了一个足够大小和复杂的基因数据库，目前，ESTs 数量正以