动物基因组DNA的分离定量叶1.ppt

凝胶上样缓冲液（6×） 蔗 糖 　　 40％ 溴酚蓝 　　 0.25％ 点 样 电 泳 注意观察溴酚蓝染液的迁移 紫外灯下观察电泳结果 照 相 电泳注意事项 1. 琼脂糖的质量： 琼脂糖（agarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。 2. DNA分子的迁移率： 影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施： (1) 每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准， 进行对照。电泳。 (2) 选择最合适的电泳条件。 (3) 提高分子筛效应，降低电荷效应。 3. EB染色：EB是核酸的显色剂，使用EB对DNA染色的3种方法： (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。 (2) 只在胶中加入EB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污染的可能。 (3) 在电泳结束后，取出凝胶，放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。 EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有EB的面朝里，有EB的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。 DNA和RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（ethidiun bromide, EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液做标准对照，可以比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1～10 ng。 EB见光易分解，故应存棕色试剂瓶中于4℃条件下保存。染色时也应避光。电泳后应立即染色观察或拍照记录。若不能马上拍照，可用保鲜膜或塑料袋封好置于4℃下过夜，核酸带型改变不大。 染色一般是在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5 μg/mL的EB，但是由于EB带正电荷，中和核酸分子的负电荷，同时它的嵌入增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于凝胶电泳测定核酸分子的大小。利用凝胶电泳比较估计或测定样品DNA的含量，也不适合在凝胶中直接加入EB，因此在凝胶中，游离的EB分子向负极游动，会使样品中前后各带染色不均匀，影响定量。故应在电泳后，将凝胶浸入0.5 μg/mL的EB水溶液中10 min进行染色。 4．溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用： 含有50%蔗糖，可增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点样孔内，起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300~400bp双链线状DNA。 5．点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。 如果DNA已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散性分布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的DNA样品不能用于进一步研究。 比较样品DNA条带与λDNA标准条带的亮度即可对样品DNA进行定量。肉眼（±10 ng），但通过图像处理设备和凝胶分析软件，分析，通过λDNA标准绘制出DNA量与条带亮度的标准曲线，估算出未知样品中的DNA含量。 另外在比较时，应该考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。 不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速度不同，据此，科研工作者们便能判断DNA的分子质量，其有无降解。同时，通过同已知分子质量的标准DNA片段之间的比较，还可以测定出随迁移的DNA片段的分子质量。 荧光分析法灵敏快速，不但能测定浓度小于0.25 μg/mL的样品，还可了解核酸样品中由于RNA或非核酸类杂质的污染而干扰紫外吸收的情形。但它的荧光强度决定于溴化乙锭嵌入碱基中的多少，这与DNA的超螺旋程度密切相关，标准品与样品难以完全一致，并且还受其它影响荧光发光污染物的影响。 准备一个对照，只放TE缓冲液。 1、分光光度计提前15 min 打开。 2、将TE－缓冲液转入紫外分光光度计的石英比色皿中，校正零点。 DNA的样品的浓度为OD260值×核酸稀释倍数×50（μg/mL