VIGS技术在植物基因功能研究中的应用.pdfVIP

维普资讯 植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年4月 379 VIGS技术在植物基因功能研究中的应用 杨迎伍，李正国 ，宋红丽，杨平 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室，重庆400044 ApplicationofVIGSinPlantGeneFunctionStudy YANG Ying—W u，LIZheng—Guo，SONGHong-Li，YANG Ping GeneticEngineeringResearchCenter,CollegeofBio—Engineering，ChongqingUniversity,KeyLaboratoryofFunctionalGeneand RegulationTechnologiesunderChongqingMunicipalEducationCommission,Chongqing400044,China 提要：文章就病毒载体选择、目标基因插入片段设计、病毒嫁接技术、环境条件控制、沉默植株检测等方面对应用病毒 诱导的基因沉默(VIGs)技术研究植物基因功能应遵循的基本原则进行介绍，并讨论了其在应用中存在的一些问题。 关键词：病毒诱导的基因沉默(VIGs)；植物基因功能；应用；基本原则 病毒诱导的基因沉默(virus．inducedgene 得可靠的数据，是人们在实际应用 中最为关心的 silencing，VIGS)是近年来发现的一种转录后基因 问题 。本文结合我们实验室 的工作 ，介绍 VIGS 沉默(post—transcriptionalgenesilencing，PTGS)现 应用过程中应该遵循的一些基本原则。 象，可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliff等 1选择合适的病毒载体 1997；王宏芝等2005)。即如果在病毒载体中插 经过几年的发展，已有多种病毒载体在VIGS 入 目标基因片段，侵染寄主植物后，植物会表现 上成功应用，如烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus． 出目标基 因功能丧失或表达水平下降的表型，从 TMV)、马铃薯X病毒(potaotvirusX，PVX)、番茄 而可以确定基因功能。其作用机制为：含有 目的 金色花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus，TGMV)、 基因片段的病毒载体在被侵染的植物组织中大量复 烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus，TRV)、卫星 制，病毒载体 中的 目的基因片段在 RNA 引导的 病毒诱导的沉默系统(satellitevirus—inducdesilencing RNA聚合酶(RNA—directedRNApolymerase，RdRP) system，SVISS)、大麦条状花叶病毒(barleystripe 作用下合成大量的双链RNA(double—strandedRNA， mosaicvirus，BSMV)、甘蓝缩叶病毒 (cabbage dsRNA)；dsRNA在Dicer酶作用下产生21~25个核 leafcurlviurs，CbLCV)等(Burch—Smith等2004； 苷酸的短干扰RNA(shortinterferingRNA，siRNA)； 王宏芝等 2005)。但每种病毒载体都存在一定的宿 然后，siRNA的反义链与RNA诱导基因沉默复合 主范围，诱导沉默效果也不同。例如PVX病毒 物 (RNA—inducedsilencingcomplex，RISC)结合， 虽然具有较好的稳定性，但只有3个植物宿主家 特异性识别细胞质中的 目的基因的单链mRNA， 族，而TMV则有9个植物宿主家族(Burnt等1996； 造成 目的基因mRNA特异性降解，从而导致 目的 Burch．Smith等2004)。而且，有些病毒载体感染 基因在RNA水平上的沉默 (Bartel2004；Burch． 植物后会引起较强烈的疾病表型，干扰 目标基因 Smith等 2004；Klahre等2002；Martinez等 2002； 沉默的表型，以致 目